Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Tandem Afinite Saflaştırma Testi

Tandem afinite saflaştırması, protein-protein etkileşimlerini incelemek için hücrelerden protein komplekslerini izole etmek için sıralı bir saflaştırma şemasıdır.

Başlamak için, ilgilenilen epitop etiketli proteinleri ifade eden bir hücre kültürü alın. Proteinler hücre içinde bir kompleks oluşturur. Kompleksteki proteinlerden biri bir Strep-tag içerirken, diğeri bir FLAG-tag ile etiketlenmiştir. Bunlar küçük sentetik peptit dizisi bazlı afinite etiketleridir.

Ortamı çıkarın ve hücreleri parçalamak için bir deterjan çözeltisi ekleyin. Hücresel kalıntıları gidermek için santrifüjleyin. Hedef protein kompleksini ve diğer hücresel proteinleri içeren süpernatanı toplayın.

Strep boncukları ekleyin - streptavidin ile kaplanmış agaroz boncuklar - ve inkübe edin. Protein kompleksinin Strep-tag'i streptavidin'e bağlanır. Protein kompleksine bağlı boncukları toplamak için santrifüjleyin. Kirletici hücresel proteinleri çıkarmak için yıkayın.

Streptavidin ile rekabetçi bir şekilde bağlanarak protein kompleksinin yerini alan bir biyotin türevi olan desthiobiotin içeren elüsyon tamponu ekleyin. Ayrıştırılmış protein kompleksini içeren bir süpernatan elde etmek için santrifüjleyin.

FLAG boncukları