Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Tandem Afinite Saflaştırma Testi

Tandem afinite saflaştırması, protein-protein etkileşimlerini incelemek için hücrelerden protein komplekslerini izole etmek için sıralı bir saflaştırma şemasıdır.

Başlamak için, ilgilenilen epitop etiketli proteinleri ifade eden bir hücre kültürü alın. Proteinler hücre içinde bir kompleks oluşturur. Kompleksteki proteinlerden biri bir Strep-tag içerirken, diğeri bir FLAG-tag ile etiketlenmiştir. Bunlar küçük sentetik peptit dizisi bazlı afinite etiketleridir.

Ortamı çıkarın ve hücreleri parçalamak için bir deterjan çözeltisi ekleyin. Hücresel kalıntıları gidermek için santrifüjleyin. Hedef protein kompleksini ve diğer hücresel proteinleri içeren süpernatanı toplayın.

Strep boncukları ekleyin - streptavidin ile kaplanmış agaroz boncuklar - ve inkübe edin. Protein kompleksinin Strep-tag'i streptavidin'e bağlanır. Protein kompleksine bağlı boncukları toplamak için santrifüjleyin. Kirletici hücresel proteinleri çıkarmak için yıkayın.

Streptavidin ile rekabetçi bir şekilde bağlanarak protein kompleksinin yerini alan bir biyotin türevi olan desthiobiotin içeren elüsyon tamponu ekleyin. Ayrıştırılmış protein kompleksini içeren bir süpernatan elde etmek için santrifüjleyin.

FLAG boncukları ekleyin - anti-FLAG antikorları ile kaplanmış agaroz boncuklar - ve inkübe edin. Protein kompleksinin FLAG etiketi antikora bağlanır. Protein kompleksine bağlı boncukları toplamak için santrifüjleyin.

Serbest FLAG peptidi içeren elüsyon tamponu ekleyin. Peptit, antikora rekabetçi bir şekilde bağlanır ve bağlı protein kompleksinin yerini alır. Saflaştırılmış protein kompleksini elüte etmek için santrifüjleyin.

İlgilenilen proteinler arasındaki etkileşimi doğrulamak için elütedeki her iki proteinin varlığını değerlendirin.

Hücre lizatı ve STREP-boncuk bulamaç karışımları 2 saat inkübe edildikten sonra, 4 santigrat derecede 2 dakika boyunca 1,1500 kez g'de döndürün. Süpernatanı "STREP AP akışı" olarak saklayın ve 4 santigrat derecede saklayın.

Boncuklara 500 mikrolitre STREP AP Yıkama Tamponu 1 ekleyin. Boncukları ve tampon karışımını 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca nutate edin ve 4 santigrat derecede 2 dakika boyunca 1.500 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve 500 mikrolitre STREP AP Yıkama Tamponu 1 ile tekrar yıkayın.

Üçüncü yıkamadan sonra, protein arka planını azaltmak için boncuk çözeltisini yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. STREP AP Yıkama Tamponu 1 ile dördüncü kez yıkayın. Döndürme işleminden sonra süpernatanı çıkarın ve 500 mikrolitre Yıkama Tamponu 2 ekleyin.

Tüpleri ters çevirerek boncukları dengeleyin ve ardından 4 santigrat derecede 2 dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün. Süpernatanı atın. 50 mikrolitre STREP elüsyon tamponu ile ilgilenilen proteini ortaya çıkarın. 800 santigrat derecede 15 dakika boyunca 4 RPM'de girdap. Boncukları 4 santigrat derecede 1 dakika boyunca 1500 kez g döndürün. Süpernatanı topla. Bu fraksiyon "STREP AP elüsyon" örneğine karşılık gelir.

İkinci bir elüsyon için boncuk fraksiyonunu 4 santigrat derecede saklayın. Gümüş boyama ve / veya batı lekeleme için STREP AP elüsyonunun% 10'unu alın.

Sonraki FLAG immünopresipitasyonu için başlangıç materyali miktarını artırmak için, FLAG elüsyonunun daha verimli bir şekilde geri kazanılması için birinci ve ikinci STREP elutiyonları bir araya getirilebilir.

Uygun miktarda FLAG boncuk solüsyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak bu prosedüre başlayın. 4 santigrat derecede 2 dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün. Süpernatanı çıkarın ve boncuklara 500 mikrolitre FLAG Yıkama Tamponu ekleyin.

4 santigrat derecede 2 dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün. Süpernatanı atın ve FLAG yıkama tamponu ile tekrar yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, süpernatanı çıkarın ve FLAG yıkama tamponundaki boncukları, n kez 16 mikrolitrelik bir nihai hacme kadar yeniden süspanse edin, burada n numune sayısıdır.

Kalan STREP AP elüsyonuna 16 mikrolitre FLAG boncuk bulamacı ekleyin ve gece boyunca 4 santigrat derecede nüteleyin. FLAG boncuk bulamacı ve STREP AP elüsyonunun gece boyunca inkübasyonunu takiben, FLAG immünopresipitasyonuna devam edin.

FLAG boncuk süspansiyonunu 1,500 santigrat derecede 2 dakika boyunca g'de 4 kez döndürün. Süpernatanı "FLAG IP akışı" olarak kaydedin ve 4 santigrat derecede saklayın.

Boncuklara 500 mikrolitre FLAG yıkama tamponu ekleyin. 4 santigrat derecede 5 dakika nutat yapın ve 4 santigrat derecede 2 dakika boyunca 1.500 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve 500 mikrolitre FLAG yıkama tamponu ile tekrar yıkayın.

Üçüncü yıkamadan sonra, arka planı azaltmak için protein boncuk çözeltisini yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. FLAG yıkama tamponu ile dördüncü kez yıkayın. Süpernatanı son dönüşten çıkarın ve boncuklara mikrolitre FLAG peptidi başına 200 nanogram içeren 30 mikrolitre FLAG yıkama tamponu ekleyin. 800 santigrat derecede iki saat boyunca 4 RPM'de girdap.

İki saat sonra, süspansiyonu 4 santigrat derecede 2 dakika boyunca 1.500 kez g döndürün. Süpernatanı hasat edin ve 4 santigrat derecede "FLAG IP elüyonu" olarak saklayın.