JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 6:05 dk • July 8th, 2025
Nükleer manyetik rezonans veya NMR spektroskopisi, atomik düzeyde protein-protein etkileşiminin tespit edilmesini sağlar.
Küresel ve sarmal proteinler arasındaki etkileşimleri incelemek için, saflaştırılmış vahşi tip veya mutant küresel proteinleri bir nitrojen izotopu olan 15N ile etiketleyin. Bir NMR tüpünde, etiketli küresel ve etiketsiz sarmal proteinleri bir NMR standardı içeren bir çözücü içinde karıştırın. Tüpü NMR spektrometresine yerleştirin.
Spektrometre mıknatısları, 15N etiketli küresel protein çekirdeğini alana paralel olarak hizalayan güçlü bir manyetik alan oluşturur. Bir radyo frekansı veya RF darbesi, alana antiparalel hizalamak için 15N-çekirdeğini uyarır.
15N çekirdeğin iki durum arasındaki geçişi için gereken darbe frekansı, rezonans frekansını tanımlar. 15N-rezonans frekansının NMR standardına normalleştirilmesi, 15N-kimyasal kaymayı ölçer.
Manyetik alan, 15N'ye bağlı 1 H-çekirdeğini alana paralel olarak hizalamak için ayarlanır. RF darbeleri ayarlanır ve 1H-kimyasal kayma kaydedilir.
Protein etkileşimleri sırasında, etkileşen amino asit kalıntılarını çevreleyen kimyasal ortam değişir, 15 N-1H kimyasal bağlarını ve karşılık gelen kimyasal kaymaları değiştirir. 15 N-1H NMR spektrumunu çizin.
Sarmal proteinler olmadan, vahşi tip küresel proteinler iyi çözülmüş spektral tepeler sergiler. Sarmal ve vahşi tip küresel proteinler etkileşime girdiğinde, spektral tepe azalır. Buna karşılık, sarmal proteinlerin mutant küresel proteinlerle inkübe edilmesi, spektral tepelerin yeniden ortaya çıkmasına neden olur ve bu da aralarında hiçbir etkileşim olmadığını gösterir.
Çıkarma komutu "ej" ile hava akışını açın. Bu, numuneyi mıknatıstan yukarı çıkaracaktır. Şimdi, numuneyi açıklıktaki mıknatısın üstündeki bir döndürücünün içine yerleştirin. "ij" komutuyla ekleyin. Devam etmeden önce numune mıknatısın içine yerleşene kadar bekleyin.
"edc" komutunu kullanarak yeni bir veri seti oluşturun ve "ZGPR" deneyini seçerek Standart Proton NMR parametrelerini yükleyin. Ad, deney numarası ve işlenmiş veri klasörü numarası alanlarını doldurun.
"Set Solvent" (Çözücüyü Ayarla) alanında çözücüyü seçin ve standart prob kafası ve çözücüye bağlı parametreleri okumak için "Execute 'getprosol'" (Execute 'getprosol') seçeneğine tıklayın. "Kilitle" komutunu kullanarak numuneyi döteryumlu çözücüye kilitleyin ve süpürme işlemi bitene ve kilitlenmeyi başarana kadar bekleyin.
"atma" otomatik ayarlama komutunu kullanarak numuneyi ayarlayarak mıknatısın rezonans frekansını düzeltin. Otomatik ayarlama tamamlanana kadar yalpalama eğrisini izleyin.
"TOPSHIM" kullanarak manyetik alanı şimleyin. Shimming, numunenin etrafında homojenlik elde etmek için manyetik alana ayarlama yapar. Aynı değerleri "wsh" komutuyla saklamak ve aynı veya benzer örnekler kullanılıyorsa topshim'den önce "rsh" kullanarak okumak iyi bir uygulamadır.
Şimdi, maksimum sinyal-gürültü oranını elde etmek için alıcı kazancını "rga" komutuyla ayarlayın. Spektrumun merkezini su rezonans ofsetine yerleştirin ve "calibo1p1" kullanarak 90 derecelik proton darbesini yüksek güçte ayarlayın.
Zero Go "zg" komutunu kullanarak proton spektrumunu toplayın ve "efp" ile işleyin. Bu, üstel çarpmayı, çizgi genişletmeyi içeren serbest indüksiyon bozunmasını, FID'nin Fourier dönüşümünü ve faz düzeltmesini uygulamak için "pk" yi içerir.
Entegrasyon seçeneği olmadan polinomu kullanarak otomatik faz düzeltmesi "apk" ve otomatik taban çizgisi düzeltmesi "absn" uygulayın. Deneyde "SFHMQC3GPPH" seçeneğini seçerek SOFAST HMBC deneyi için yeni bir veri seti oluşturun.
Proton spektrumundan optimize edilmiş P1 ve O1'i kopyalayın ve P1'in optimize edilmiş P1 değeri ve plw1'in P1 için güç seviyesi olduğu "getprosol 1H p1 plw1" komutunu kullanarak P1'e bağımlı darbeleri doldurun. Şimdi, amid kimyasal kayması için ofseti ayarlamak için CNST54 sabitini optimize edin. Ayrıca, CNST55'i, ilgilenilen spektral bölgeleri kapsayacak şekilde bant genişliğini tanımlamak için optimize edin ve alıcı kazancının optimize edilmesini sağlayın.
Bu parametreleri seçmek için, iki boyutlu spektrumdan ilk FID'yi çıkarın ve bunları tanımlamak için gözlemlenen sinyali arayın. Ek olarak, veri kalitesini gerçek zamanlı olarak izlemek için go ve taramayı sağlayan "gs" komutuyla kabul edilebilir sinyal hassasiyeti elde etmek için gevşeme gecikmesini, tarama sayısını ve sahte taramaları değiştirin. Son olarak, Zero Go "zg" kullanarak spektrumları kaydedin.