Bir Hedef Proteine Yüksek Afiniteye Sahip Proteinleri Seçmek için Faj Ekranını Kullanma

Hedef protein ile kaplanmış çok kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına bir faj kütüphanesi ekleyerek faj gösterimine başlayın. Faj kütüphanesi, genetik olarak tasarlanmış fajlar içerir ve her biri yüzeyinde bir kaplama proteinine kaynaşmış ayrı bir protein varyantı gösterir. İnkübe edin, faj ve hedef proteinlerin etkileşime girmesine izin verin.

Hedef protein afinitesi yüksek proteinlere sahip fajlar, hedef proteine bağlanır. Bağlanmamış fajları çıkararak bir tamponla yıkayın. Asidik bir çözelti ekleyin, faj ve hedef protein etkileşimlerini bozun, fajları çözeltiye salın. Faj stabilitesini koruyarak çözelti pH'ını bir tampon kullanarak nötralize edin.

Fajları yeni bir tüpe aktarın. Spesifik olmayan etkileşimleri önleyerek protein içeren bir bloke edici çözelti ile inkübe edin.

Fajları aktif olarak bölünen bir E. coli süspansiyonuna aktarın, bakterileri enfekte edin ve faj replikasyon döngüsünü başlatın. Bakterileri enfekte eden yardımcı fajlarla takviye edin ve döl fajlarını paketlemek için gerekli kaplama proteinlerini sağlayın. Süspansiyonu, fajla enfekte olmuş bakteri üremesine izin veren seçici bir ortama aktarın.

Döl fajları sonunda ortama salınır. Merkezkaç. Süpernatan içeren fajları toplayın. Faj parçacıklarını konsantre eden bir çökeltme çözeltisi ekleyin. Merkezkaç. Faj peletini bir tampon içinde tekrar süspanse ederek homojen bir süspansiyon elde edin.

Sonraki faj seçim turlarını gerçekleştirin; faj-hedef protein bağlanmasını, artan tampon yıkama sıkılık adımı ile elüsyonu ve amplifikasyon ve santrifüjleme adımlarını tekrarlayın, bu da hedef proteine yüksek afiniteye sahip proteinleri gösteren faj havuzlarının zenginleşmesine neden olur.

Faj kütüphanesini buz üzerinde çözün. Ardından, PBS'deki kütüphane çeşitliliğinin 100 katına kadar seyreltin. Polietilen glikol/sodyum klorür çözeltisini seyreltilmiş kütüphane hacminin 1 / 5'ine ekleyin ve çözeltiyi buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, çözeltiyi dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 11.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve kalan süpernatanı aşağı çekmek ve faj peletini konsantre etmek için iki dakika daha santrifüjleyin.

Faj peletini, analiz edilecek hedef protein başına bir mililitre PBT tamponunda, tipik olarak toplamda dört adet nazikçe yeniden süspanse edin. Kontrol plakasındaki her kaplanmış kuyucuğa 100 mikrolitre faj kütüphanesi ekleyin. 300 RPM orbital çalkalama ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

PB tamponunu hedef plakadan lavaboya atın ve plakayı kağıt havlu üzerinde kurulayın. Kontrol plakasındaki faj kütüphanesinin 100 mikrolitresinin tamamını hedef plakanın kaplanmış her bir kuyucuğuna aktarın. 300 RPM orbital çalkalama ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Daha sonra, faj kütüphanesini plakadan çıkarın ve kaplanmış kuyucukları PT tamponu ile dört kez yıkayın. Plakayı ters çevirin ve tamponun son damlalarını çıkarmak için bir kağıt havluya hafifçe vurun. Fajı çıkarmak için kaplanmış her kuyucuğa 100 mikrolitre 0.1 molar hidroklorik asit ekleyin. Plakayı 300 RPM orbital çalkalama ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.

Bundan sonra, kaplanmış her bir oyuğa 12.5 mikrolitre pH 11 bir molar Tris hidroklorür ekleyerek pH'ı nötralize edin. Ayrıştırılan fajı sekiz kuyucuğun hepsinden tek bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Çözeltileri homojen hale getirmek için aktarım sırasında yukarı ve aşağı pipetleyin ve kuyulardaki tüm sıvıyı aspire edin. Son konsantrasyonu %1 yapmak için ayrıştırılan faja% 10 BSA ekleyin.

Mikrosantrifüj tüpünü dört santigrat derecede saklayın. Bu birinci tur çıktıdır. Beş mililitre 2YT/Tetrasiklin tohum kültürünü bir agar plakasından izole edilmiş bir E. coli kolonisi ile aşılayarak bir sonraki seçim turu için faj girdisini kültürlemek için bir tohum kültürü hazırlayın.

200 RPM orbital çalkalama ile 37 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Hedef proteini ikinci ve üçüncü tüplerdeki turlarda uygun miktarda PBS ile seyreltin. İkinci ve üçüncü tüp turlarının içeriğinin yarısını alın ve bir sonraki tur için 96 oyuklu bir bağlayıcı plakada hedef protein başına dört kuyucuk kaplayın.

Ardından, üç mililitre orta log faz hücresini aşılamak için birinci turun yarısını kullanın. 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca 200 RPM orbital sallama ile inkübe edin. M13KO7 Yardımcı Fajını mililitre başına 10 milyar pfu'luk bir nihai konsantrasyona ekleyin. 37 RPM orbital sallama ile bir saat boyunca 200 santigrat derecede tekrar inkübe edin.

Bir saat sonra, üç mililitre kültürün tamamını 30 mililitre 2YT / Karbenisilin / Kanamisin çözeltisine aktarın. 200 RPM orbital sallama ile gece boyunca 37 santigrat derecede büyüyün.