Bimoleküler Floresan Tamamlama-Birleştirilmiş Fotoaktif Lokalizasyon Mikroskobu

Aktif formunda, plazma zarı ile ilişkili Ras monomeri - bir guanin nükleotid bağlayıcı protein - Ras bağlama alanı yoluyla Ras'a bağlanan aktif olmayan bir protein kinaz olan Raf'ı işe alır.

Bu bağlama, aşağı akış sinyalizasyon sürecini tetikleyen işlevsel bir Ras-Raf kompleksi ile sonuçlanır.

Hücre içi Ras-Raf etkileşimini görselleştirmek için, iyi odacıklı bir slaytta genetik olarak tasarlanmış hücrelerin bir süspansiyonu ile başlayın. Bu hücreler, floresan olmayan iki füzyon proteinini eksprese eder - biri, N-terminali aracılığıyla fotoaktive edilebilir bir floroforun yarısına bağlı Ras'ı içerir ve diğeri, C-terminalinde aynı floroforun diğer yarısına kaynaşmış Raf'tır.

Hücrelerin içinde, Ras içeren füzyon proteinleri plazma zarına kenetlenir ve Raf içeren füzyon proteinleri ile etkileşime girerek floresan proteinin parçalarını tam bir fotoaktive edilebilir florofora yeniden oluşturur. Ras ve Raf bağlanmasının olmaması, iki florofor yarısını ayrı tutar.

Slayta sabitleyici bir reaktif ekleyin. Fiksatif moleküller proteinlerle çapraz bağlar oluşturur ve protein komplekslerini stabilize eder.

Fiksatif reaktifi çıkarın ve bir görüntüleme tamponu ekleyin. Slaytı, fotoaktif lokalizasy