Genomik DNA Üzerindeki Hedef Protein Bağlanma Bölgelerini Belirlemek için Kromatin İmmünopresipitasyonu

Bir hedef proteinin DNA üzerindeki bağlanma yerlerini belirlemek için, kromatindeki spesifik DNA dizilerine çapraz bağlı bir hedef protein içeren oligodendrosit öncü hücreleri ile başlayın.

Hücreleri proteaz inhibitörleri içeren bir lizis tamponu ile tedavi edin. Lizis tamponu hücreleri parçalarken, inhibitörler protein-kromatin komplekslerinin bütünlüğünü korumak için proteazları inaktive eder.

Kompleksleri daha küçük kromatin parçalarına kesmek için içeriği sonikleştirin, bazıları hedef proteini koruyarak.

Hücre bileşenlerini peletlemek için santrifüjleyin ve süpernatan içeren kromatin parçalarını yeni bir tüpe aktarın. Kromatin fragmanları üzerindeki hedef proteine spesifik olarak bağlanan anti-hedef antikorlarla inkübe edin.

Tüpü, önceden bağlanmış antikorların Fc bölgesine bağlanan protein A kaplı manyetik boncuklarla destekleyin. Kromatin fragmanları ile komplekslenmiş antikora bağlı hedef proteinleri seçici olarak çökeltmek için bir manyetik alan uygulayın.

Protein-kromatin etkileşimlerini bozmak ve ilişkili proteinler olmadan çıplak DNA'yı serbest bırakmak için boncuk komplekslerini yüksek tuz içeren bir elüsyon tamponu ile muamele edin.

DNA'yı çıkarmak için organik çözücüler kullanın. Bir amplifikasyon tamponu ekleyin ve DNA parçalarını çoğaltmak için bir polimeraz zincir reaksiyonu çalıştırın. Amplifikasyon sonrası, DNA dizisini analiz edin.

Amplifiye edilmiş ürünlerin dizisini hücrenin genomik DNA dizisiyle karşılaştırın. Protein bağlanma bölgeleri ile ilişkili olarak, fragman ve genomik DNA arasında bir dizi eşleşmesi olan bölgeyi bulun.

Bir hemositometrede saydıktan sonra, ChIP reaksiyonu için 1 mililitre OPC hücre kültürü ortamına 20.000 saflaştırılmış OPC ekleyin. Ardından, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 27 mikrolitre% 36.5 formaldehit ekleyin. Bu hücreleri düzeltir.

10 dakika sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca sabit hücrelerin üzerine 50 mikrolitre 2.5 molar glisin ekleyin. Glisin eklemek, DNA-protein çapraz bağlanmasını durduracaktır. Daha sonra, çapraz bağlı hücreleri proteaz inhibitör kokteyli ile 1 mililitre HBSS tamponu ile yıkayın. Daha sonra, hücreleri önceden soğutulmuş bir santrifüj makinesinde 4 santigrat derecede 300 kez g santrifüjleyin.

Saflaştırılmış OPC'ler çapraz bağlandıktan sonra, çapraz bağlı hücreler buz gibi soğuk HBSS çözeltisi kullanılarak yıkanmalı ve kalan ChIP adımları 4 derecede gerçekleştirilmelidir. Aksi takdirde, antikor genomik DNA'yı düzgün bir şekilde çökeltemez.

Daha sonra, hücre peletine 25 mikrolitre tam lizis tamponu ekleyin ve 5 dakika buz üzerinde bırakın. Ardından, proteaz inhibitörü kokteyli ile 75 mikrolitre buz gibi HBSS tamponunu pipetleyin. Daha sonra, hücre lizatının kromatinini, 30 saniye AÇIK ve 30 saniye KAPALI programından oluşan beş döngü ile önceden soğutulmuş bir sonikasyon sisteminde kesin.

Kromatin kesildikten sonra, hücre lizatını 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 14.000 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemenin sonunda süpernatanı toplayın. Daha sonra, 100 mikrolitre kesilmiş kromatini, proteaz inhibitörü ile eşit hacimde buz gibi soğuk ChIP tamponu ile seyreltin.

Daha sonra, 180 mikrolitre seyreltilmiş kesilmiş kromatine 1 mikrolitre Tavşan anti-olig2 antikoru ekleyin. Tüpleri dönen bir tekerlek üzerinde 16 saat boyunca 4 santigrat derecede dakikada 40 devirde inkübe edin. Daha sonra, soğuk bir odada ChIP reaksiyon tüpüne 10 mikrolitre önceden yıkanmış Protein A kaplı boncuklar ekleyin. Yine, ChIP tüplerini dönen tekerlek üzerinde 2 saat daha 4 santigrat derecede inkübe edin.

2 saat sonra, ChIP reaksiyon tüpünü bir dakika manyetik rafta bırakın. Ardından, boncuk peletini 100 mikrolitre dört yıkama tamponu ile her biri 4 dakika boyunca 4 santigrat derecede dönen bir tekerlek üzerinde yıkayın. Sonra, boncuk peletine 200 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin. Reaksiyon tüpünü 65 santigrat derecede 4 saat inkübe edin.

Çift sarmallı DNA denatüre edildikten sonra, karides alkalin fosfataz ekleyerek tek sarmallı DNA'nın 3 asal ucunu defosforile edin. Ardından, terminal deoksinükleotidil transferaz kullanarak tek sarmallı DNA'ya poli(T) kuyruğu ekleyin. Ardından, DNA poli-(dA) primerini tek sarmallı DNA şablonuna tavlayın. Ardından, indeksleme için ileri ve geri primerleri kullanarak ChIP dizi kitaplığını yükseltin.

Kütüphane hazırlığı için PCR döngülerinin sayısı, başlangıç DNA'sının miktarına bağlıdır. İyi bir kütüphane hazırlığı, girdi DNA miktarının doğru bir şekilde ölçülmesini gerektirir. Çok fazla veya çok az PCR döngüsü, kütüphane konsantrasyonunu ve karmaşıklığı etkileyerek PCR artefaktlarına yol açabilir.

PCR ile güçlendirilmiş ChIP dizi kitaplığından 250 ila 500 baz çifti arasında değişen parçaları seçmek için paramanyetik boncuklar kullanın. Seçilen ChIP dizi kitaplığının kalitesini incelemek için mikroakışkan bir ChIP kapiler elektroforez cihazı kullanın.