Bir Hedef Genin Translasyonel Regülasyonunu İncelemek için Raportör Gen Baskılama Testi

RNA bağlayıcı proteinler, RBP'ler, mRNA'nın translasyon başlatma bölgesine, TIR'a bağlanarak ve translasyonu baskılayarak transkripsiyon sonrası düzenleyiciler olarak işlev görür.

Bir raportör genin translasyonel baskılanması yoluyla RNA-RBP etkileşimlerini incelemek için, iki plazmit içeren bir bakteri hücre kültürü alın - bağlanma bölgesi ve RBP plazmitleri.

Bağlanma bölgesi plazmidi, bir floresan raportör genini kodlar. Transkripsiyon üzerine, ortaya çıkan mRNA'nın TIR'ı, RBP'ler tarafından tanınan bir diziye sahip bir ribozom bağlama bölgesi ve bir saç tokası yapısı içerir.

Ribozomlar, mRNA üzerindeki bağlanma bölgesine bağlanır ve firkete yapısını kararsızlaştırarak mRNA translasyonuna ve floresan raportör protein oluşumuna yol açar. RBP plazmiti, farklı bir floresan proteinine kaynaşmış kimerik bir RBP'yi ifade eder. İndüklenebilir bir promotör, kimerik protein ekspresyonunu kontrol eder.

Promotöre bağlanan ve kimerik protein ekspresyonunu indükleyen bir transkripsiyon faktörünü aktive eden indükleyiciyi ekleyin. Kimerik proteinin RBP'si saç tokası yapısına bağlanır. Bu, ribozomun mRNA'ya bağlanmasını bloke ederek raportör protein translasyonunu inhibe eder.

Artan indükleyici konsantrasyonu ile, RBP üretimi artar ve bu da mRNA'ya ribozomal bağlanmanın daha güçlü bir rekabetçi inhibisyonu ile sonuçlanır.

Kimerik ve raportör proteinlerden gelen farklı floresan sinyallerini ölçün. Doz-yanıt eğrisini elde ederek sinyalleri çizin.

RBP üretimindeki indükleyici aracılı artışla, translasyonel baskılama, raportör protein konsantrasyonunu azaltarak RNA-RBP etkileşimini doğrular.

Hazırlanan plazmitleri, halihazırda bir RBP-mCerulean plazmid içeren kimyasal olarak yetkin bakteri hücrelerine dönüştürün. Zaman kazanmak için, hücreleri ilgili antibiyotiklerle Luria-Bertani agar içeren 8 şeritli plakalara 8 kanallı bir pipetleyici kullanarak plakalayın. Koloniler 16 saat içinde 37 santigrat derecede görünmelidir.

Her çift dönüştürücü için tek bir koloni seçin ve uygun antibiyotiklerle 1.5 mililitre LB içeren 48 oyuklu plakalara aktarın. Hücreleri 18 saatlik bir süre boyunca 37 santigrat derecede büyütün, 250 RPM'de sallayın. Gece boyunca gliserol stoklarını -80 santigrat derecede 96 oyuklu plakalarda saklayın.

Sabahları, robotu 96 oyuklu plakalarda 180 mikrolitre yarı fakir ortamı veya SPM'yi ısıtmaya programlayın. İndüktör plakasını hazırlamak için robotu programlayın.

Temiz bir 96 oyuklu plakada,% 95 BA ve% 5 LB'den oluşan SPM ile kuyular hazırlayın. Kuyu sayısı, istenen indükleyici konsantrasyon sayısına karşılık gelir. En yüksek indükleyici konsantrasyonunu içerecek olan indükleyici plakasındaki kuyucuklara C4-HSL ekleyin.

Ardından, robotu, en yüksek konsantrasyonlu kuyucukların her birinden ortamı 0 ila 218 nanomolar arasında değişen 23 düşük konsantrasyona seri olarak seyreltecek şekilde programlayın. Her bir indükleyici seyreltmesinin hacmi tüm suşlar için yeterli olmalıdır.

Gece boyunca suşları seyreltmek için, robotu 48 oyuklu plakalarda 20 mikrolitre bakteri ile 180 mikrolitre SPM karıştırarak 10 kat seyreltecek şekilde programlayın. Daha sonra seyreltilmiş çözeltiden 20 mikrolitre alarak floresan ölçümlerine uygun önceden hazırlanmış gerinim plakasına tekrar 10 kat seyreltin.

Şimdi robotu, seyreltilmiş indükleyiciyi indükleyici plakasından nihai konsantrasyonlara göre seyreltilmiş suşlarla birlikte 96 oyuklu plakalara ekleyecek şekilde programlayın. 96 oyuklu plakaları 37 santigrat derecede 6 saat çalkalayın. Bu süre zarfında, her 30 dakikada bir bir plaka okuyucu aracılığıyla 595 nanometrede optik yoğunluk veya OD'nin yanı sıra mCherry ve mCerulean floresan ölçümlerini alın.