Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşimlerini Tespit Etmek için Modifiye Maya-Bir Hibrit Testi
JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 4:12 dk. • July 8th, 2025
Modifiye maya tek hibrit tahlili kullanarak hedef DNA ile birden fazla proteini içeren heteromerik protein kompleksleri arasındaki etkileşimleri tespit etmek için, aktif olarak büyüyen, dönüştürülmüş bir maya hücre kültürünün istenen konsantrasyonunu içeren çok kuyulu bir plaka alın.
Bu hücreler, endojen GAL-4 transkripsiyon faktörü proteininden yoksunken, GAL-4 promotörü tarafından yönlendirilen raportör β-galaktosidaz kodlayan genin yukarı akışında spesifik bir DNA dizisi içerir. Hücreler, GAL-4 aktivasyon alanına kaynaşmış bir hedef proteini ve GAL-4 DNA bağlama alanından yoksun başka bir proteini eksprese eder.
Bu proteinler etkileşime girerse, hedef proteinin raportör genin promotör bölgesindeki yukarı akış DNA dizisine bağlanmasını sağlayan bir kompleks oluşturabilirler. GAL-4 aktivasyon alanı, raportör β-galaktosidaz enzim ekspresyonunu aktive eder.
merkezkaç. Hücreleri uygun bir tamponda yeniden süspanse edin. Hücreleri parçalamak için dondurun-çözün ve β-galaktosidazı serbest bırakın. Beta-merkaptoetanol ve β-galaktosidaz substrat içeren bir tampon ekleyin.
Beta-merkaptoetanol, β-galaktosidaz enzimini stabilize eder. β-galaktosidaz, β-galaktosidaz substratını hidrolize ede
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin