JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 4:12 dk. • July 8th, 2025
Modifiye maya tek hibrit tahlili kullanarak hedef DNA ile birden fazla proteini içeren heteromerik protein kompleksleri arasındaki etkileşimleri tespit etmek için, aktif olarak büyüyen, dönüştürülmüş bir maya hücre kültürünün istenen konsantrasyonunu içeren çok kuyulu bir plaka alın.
Bu hücreler, endojen GAL-4 transkripsiyon faktörü proteininden yoksunken, GAL-4 promotörü tarafından yönlendirilen raportör β-galaktosidaz kodlayan genin yukarı akışında spesifik bir DNA dizisi içerir. Hücreler, GAL-4 aktivasyon alanına kaynaşmış bir hedef proteini ve GAL-4 DNA bağlama alanından yoksun başka bir proteini eksprese eder.
Bu proteinler etkileşime girerse, hedef proteinin raportör genin promotör bölgesindeki yukarı akış DNA dizisine bağlanmasını sağlayan bir kompleks oluşturabilirler. GAL-4 aktivasyon alanı, raportör β-galaktosidaz enzim ekspresyonunu aktive eder.
merkezkaç. Hücreleri uygun bir tamponda yeniden süspanse edin. Hücreleri parçalamak için dondurun-çözün ve β-galaktosidazı serbest bırakın. Beta-merkaptoetanol ve β-galaktosidaz substrat içeren bir tampon ekleyin.
Beta-merkaptoetanol, β-galaktosidaz enzimini stabilize eder. β-galaktosidaz, β-galaktosidaz substratını hidrolize ederek sarı bir kromojen oluşturur.
β-galaktosidazı denatüre etmek için sodyum karbonat çözeltisi ekleyin ve reaksiyonu durdurun. Merkezkaç. Sarı kromojen içeren süpernatanı çok kuyulu bir plakaya aktarın. Bir plaka okuyucu kullanarak, β-galaktosidaz aktivitesini hesaplamak için çözeltinin optik yoğunluğunu uygun bir dalga boyunda ölçün.
Daha yüksek β-galaktosidaz aktivitesi, proteinler ve hedef DNA dizisi arasındaki pozitif etkileşimleri gösterir, bu da β-galaktosidaz ekspresyonuna yol açar.
Kültürü yeniden askıya alın ve her oyuktan 125 mikrolitreyi bir spektrofotometre plakasına aktarın. 0,3 ile 0,6 arasında olduğundan emin olmak için optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün. Derin kuyu bloğunda kalan hücreleri 10 dakika boyunca 3.000 kez g ve 21 santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı ters çevirerek çıkarın.
Her kuyucuğa 200 mikrolitre Z-tamponu ekleyin ve girdap yapın. 5 dakika boyunca 3.000 kez g ve 21 santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı ters çevirerek çıkarın. Her kuyucuğa ve girdaba 20 mikrolitre Z-tamponu ekleyin. Plakayı donma-çözülme döngülerine dayanıklı sızdırmazlık folyosu ile örtün.
Bir çeker ocakta, 42 santigrat derecelik bir su banyosunda sıvı nitrojen kullanarak dört döngü donma-çözülme gerçekleştirin. Her kuyucuğa 200 mikrolitre taze hazırlanmış Z-tampon / beta-merkaptoetanol / ONPG çözeltisi ekleyin. 30 santigrat derecede 17 ila 24 saat veya renk gelişene kadar inkübe edin. Rengin gelişip gelişmediğini kontrol edin.
Reaksiyonu durdurmak için her kuyucuğa 110 mikrolitre 1 molar sodyum karbonat ekleyin. Zamanı kaydedin ve plakayı girdaplayın. 10 dakika boyunca 3.000 kez g ve 21 santigrat derecede santrifüjleyin. Her kuyucuktan 125 mikrolitre süpernatanı bir spektrofotometre plakasına aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Optik yoğunluğu 420 nanometrede ölçün.