Biotin etiketli RNA dupleksleri kullanılarak bir hedef proteinin helikaz aktivitesi ölçümü

RNA helikaz aktivitesine sahip proteinler, bir RNA dupleksinde tek tek RNA moleküllerinin çözülmesine ve ayrılmasına yardımcı olabilir.

Bir proteinin helikaz aktivitesini belirlemek için, 5' çıkıntılı biyotin etiketli RNA dubleksleri, ATP'ler ve RNA tuzaklarının bir karışımını içeren tüpleri alın - dublekslerin biyotinile ipliklerini tamamlayan etiketlenmemiş iplikler.

Her tüpe helikaz aktivitesine sahip proteini ekleyin ve farklı süreler boyunca inkübe edin. Protein, dublekslerin 5' çıkıntısına bağlanır.

ATP moleküllerini kullanarak, iki dubleks iplik arasındaki hidrojen bağlarını kırar, bu da bunların çözülmesine ve biyotinile edilmiş tek sarmallı RNA'nın serbest kalmasına neden olur. RNA tuzakları, biyotin etiketli ipliklerle etkileşime girerek, ayrılan ipliklerle yeniden tavlanmayı önler.

Bir sonlandırma tamponu kullanarak reaksiyonu sonlandırın.

Numuneleri doğal bir poliakrilamid jelin farklı kuyucuklarına yükleyin. Elektroforez çalıştırın. Düşük moleküler ağırlıklı, tek sarmallı RNA, yüksek moleküler ağırlıklı dublekslerden daha hızlı hareket eder. Bu hareketlilik değişimi iki farklı bant oluşturur.

Jeli naylon bir zar üzerinde kurulayın, RNA'ları zara aktarın. Lekeleme sonra