Biotin etiketli RNA dupleksleri kullanılarak bir hedef proteinin helikaz aktivitesi ölçümü

RNA helikaz aktivitesine sahip proteinler, bir RNA dupleksinde tek tek RNA moleküllerinin çözülmesine ve ayrılmasına yardımcı olabilir.

Bir proteinin helikaz aktivitesini belirlemek için, 5' çıkıntılı biyotin etiketli RNA dubleksleri, ATP'ler ve RNA tuzaklarının bir karışımını içeren tüpleri alın - dublekslerin biyotinile ipliklerini tamamlayan etiketlenmemiş iplikler.

Her tüpe helikaz aktivitesine sahip proteini ekleyin ve farklı süreler boyunca inkübe edin. Protein, dublekslerin 5' çıkıntısına bağlanır.

ATP moleküllerini kullanarak, iki dubleks iplik arasındaki hidrojen bağlarını kırar, bu da bunların çözülmesine ve biyotinile edilmiş tek sarmallı RNA'nın serbest kalmasına neden olur. RNA tuzakları, biyotin etiketli ipliklerle etkileşime girerek, ayrılan ipliklerle yeniden tavlanmayı önler.

Bir sonlandırma tamponu kullanarak reaksiyonu sonlandırın.

Numuneleri doğal bir poliakrilamid jelin farklı kuyucuklarına yükleyin. Elektroforez çalıştırın. Düşük moleküler ağırlıklı, tek sarmallı RNA, yüksek moleküler ağırlıklı dublekslerden daha hızlı hareket eder. Bu hareketlilik değişimi iki farklı bant oluşturur.

Jeli naylon bir zar üzerinde kurulayın, RNA'ları zara aktarın. Lekeleme sonrası, zarı UV ışığına maruz bırakın ve RNA'ları zar üzerine çapraz bağlayın.

Dubleksler ve tek sarmallı iplikler üzerinde biyotin ile etkileşime giren kemilüminesan enzim konjuge streptavidin ekleyin. Kemilüminesans ürünleri üretmek için kemilüminesan substratlar kullanın.

Görüntüleme üzerine, düşük moleküler ağırlıklı bandın yoğunluğu, hedef proteinin helikaz aktivitesi ile ilişkili olarak zamanla artar.

MOV10 helikaz aktivite deneyi için, reaktifleri el yazması talimatlara göre karıştırın ve 20 mikrolitrelik bir son reaksiyon hacmi için su ekleyin. Reaksiyonu 37 santigrat derecede 10 dakika, 30 dakika ve 60 dakika inkübe edin ve ardından reaksiyonu durdurmak için 5X Durdurma Tamponu ekleyin. Ardından, %20'lik bir doğal poliakrilamid jel hazırlayın ve her bir numuneden 20 ila 25 mikrolitre doldurun. Bromofenol mavisi işaretleyici jelin alt çeyreğine geçene kadar jeli bir buz banyosunda 100 voltta çalıştırın.

Akrilamid zararlı ve toksiktir. Uygun kişisel koruyucu ekipmanla kullanılması önemlidir.

Jel plakalarını sökün ve yükleme kuyularını ve kullanılmayan şeritleri çıkararak jeli düzeltin. Jeli 0.5X TBE tamponuna yerleştirin. Filtre kağıdını ve naylon zarı jelin boyutuna göre kesin, kağıdı ve zarı önceden ıslatın ve aktarım için yığını birleştirin.

Numuneleri jelden zara 90 miliamperde 20 dakika boyunca yarı kuru bir elektroforetik aparat içinde aktarın. Ardından, zarı 45 ila 60 saniye boyunca santimetre kare başına 120 milijoule ışınlayarak numuneleri çapraz bağlayın.

Kemilüminesans tespiti için, zara 20 mililitre bloke edici tampon ekleyerek ve hafifçe çalkalarken 15 ila 30 dakika inkübe ederek başlayın. Engelleme arabelleğini dikkatlice çıkarın ve eşlenik engelleme arabelleği ile değiştirin. Membranı tekrar 15 dakika inkübe edin.

Membranı her yıkamada 5 dakika çalkalayarak dört kez yıkayın. Ardından, zara 30 mililitre substrat dengeleme tamponu ekleyin ve 20 ila 25 RPM'de çalkalarken 5 dakika inkübe edin.

Membranın tüm yüzeyini substrat çalışma solüsyonu ile kaplayın ve 5 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, zarı kemilüminesan bir görüntüleme sisteminde 1 ila 3 saniye boyunca tarayın.