DNA Onarım Protein Etkileşimlerinin İmmünofloresan Tabanlı Görselleştirilmesi

Radyasyona bağlı DNA çift iplikli kırılmalar veya DSB'ler, hasarlı bölgede DNA onarım proteini alımını başlatır ve DNA onarımını aktive eder.

Dolaylı immünofloresan kullanarak DSB bölgelerinde DNA onarım proteinleri γH2AX ve 53BP1'i tespit etmek için, epitel hücreleri içeren lameller alın. Hücrelerin bir alt kümesini ışınlayın. İnkübe edin, kontrol ışınlanmamış ve ışınlanmış hücrelerin belirli süreler için büyümesine izin verin.

Hücre çekirdeğini çıkarmak için bir tampon ile muamele edin. Morfolojilerini korumak için hücre çekirdeklerini sabitleyin. Spesifik olmayan primer antikor bağlanmasını en aza indirmek için bir bloke edici solüsyon ile tedavi edin.

İki DNA onarım proteinini hedef alan birincil antikorlar ekleyin. Antikorlar ilgili proteinlere bağlanır.

Sırasıyla kırmızı ve yeşil floroforlarla etiketlenmiş ikincil antikorlarla inkübe edin. İkincil antikorlar - her bir birincil antikor için spesifik - hedeflerine bağlanır. Bir cam slayt üzerine DAPI içeren montaj ortamı ekleyin. Görüntüleme için lamellerin üzerine monte edin.

DNA bağlayıcı bir boya olan DAPI, çift sarmallı DNA'nın AT açısından zengin küçük oluklarına bağlanarak çekirdekleri boyar. Bir floresan mikroskobu kullanarak hücre çekirdeklerini görselleştirin.

Işınlanmamış hücre çekirdekleri ile karşılaştırıldığında, ışınlanmış çekirdekler, zamanla azalan çoklu γH2AX odakları sergiler, bu da daha uzun süreler boyunca büyüyen hücrelerde ilerleyici DNA onarımını gösterir.

Örtüşen kırmızı ve yeşil floresan sinyalleri sarı renkte görünür, bu da ışınlamayı takiben DSB bölgesinde γH2AX ve 53BP1'in birlikte lokalizasyonunu gösterir.

18 milimetre yuvarlak cam lamel ile 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda 40.000 HeLa hücresini% 80 birleşmeye kadar büyüterek başlayın. Hücreleri 4 Gri gama ışınlamasına maruz bıraktıktan sonra, 1 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, PBS'yi tamamen çıkarın ve her kuyucuğa 200 mikrolitre NEB ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin, ardından NEB'yi çıkarın.

Kuluçka süresinin hücre hattına bağlı olarak değişebileceğini, ancak genellikle iki dakikayı geçmemesi gerektiğini unutmayın. Hücreleri 1 mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, PBS'yi tamamen çıkarın ve hücre fiksasyonu için her oyuğa 200 mikrolitre% 4 PFA ekleyin.

Hücreleri 4 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin, ardından PFA'yı çıkarın ve her oyuğa 1 mililitre PBS ekleyin. PBS'yi tamamen çıkarın ve daha sonra her bir oyuğa 200 mikrolitre bloke edici çözelti ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 2 saat veya 4 santigrat derecede 16 ila 18 saat inkübe edin.

Birincil antikoru seyreltme tamponunda seyreltin ve iyice karışana kadar girdaplayın. Bir nem kutusuna, bir parça parafilm yapıştırın ve tek bir damlada 10 mikrolitre birincil antikor ekleyin. Lamelin bir kenarını kuyudan damla ile hizalayın ve sıvıyı yayarak yavaşça parafilmin üzerine indirin. Lameli oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, lamelleri PBS'de yıkama başına 1 dakika boyunca üç kez yıkayın. İkincil antikoru seyreltme tamponunda seyreltin ve iyice karışana kadar girdap haline getirin. Daha önce tarif edildiği gibi her bir lamele 10 mikrolitre ikincil antikor uygulayın ve ışıktan korunarak oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.

Lamelleri PBS ile üç kez ve bir kez suyla - yıkama başına 1 dakika boyunca yıkayın. Ardından, DAPI içeren gliserol bazlı bir montaj ortamı ile cam slaytlara monte edin. Lamelleri şeffaf oje ile kapatın ve 20 dakika kurumaya bırakın. 60X objektif merceğine bir damla daldırma yağı koyun ve çekirdeği göz merceğinden bulmak için DAPI'yi kullanın.

XYZ görüntü alımı için, alma yazılımını açın ve "Tarayıcı tipi"ni "Galvano", "Tarayıcı modu"nu "Gidiş-Dönüş" ve "512 x 512" görüntü boyutunu ayarlayın. PMT panelinde, modu VBM olarak, ortalamayı Çerçeve olarak ve sıralı taramayı Çizgi olarak ayarlayın. Ardından, boya ve ısı dedektörlerini ayarlayın. Kanal 1'i DAPI ve SD1'e, ikinci kanalı Alexa Fluor 488 ve HSD3'e ve kanal 3'ü Alexa Fluor 647 ve HSD4'e ayarlayın. "Z" de "AÇIK" ı seçin.

Canlı görüntüyü ayarlamak için Canlı Penceredeki Canlı düğmesine basın ve odağı ayarlayın. Ardından, lazer yoğunluğunu, hassasiyetini, kazancını ve ofsetini ayarlamak için "PMT aracı" penceresini kullanın. Z yığınları için Başlangıçtan Bitişe ve 15 Dilim'i seçin. Görüntülerin kaydedileceği klasörü seçin ve almayı başlatmak için LSM Başlat düğmesine basın. Bitirdiğinizde, görüntü alımını tamamlamak için Seri Bitti düğmesine basın.