Afinite Ekstraksiyonu Yoluyla RNA Bağlayıcı Proteinleri İzole Etmek için RNA-Protein Pull-Down Testi

RNA bağlayıcı proteinleri veya RBP'leri izole etmek için - transkripsiyon sonrası düzenleyiciler - adenilat-üridilat açısından zengin bir element veya ARE - hedef RBP'ler tarafından tanınan bir dizi içeren küçük RNA problarının bir süspansiyonunu alın. RNA probları, bir biyotin türevi olan desthiobiotin ile etiketlenmiştir.

Biotin için afinitesi olan bir protein olan streptavidin ile kaplanmış manyetik boncuklar ekleyin. Boncukların çökelmesini önlemek için çalkalama altında inkübe edin. Desthiobiotin etiketli RNA, streptavidine bağlanır, böylece RNA'yı boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirir.

Manyetik alanın altında, boncuklar tüpün yan tarafında toplanır. Süpernatanı çıkarın. RBP-RNA bağlanması için optimum bir pH sağlayan boncukları bir tampon içinde yeniden süspanse edin.

Mıknatısa maruz kaldığında, boncuklar tüpün yan tarafında toplanır. Süpernatanı atın. Boncukları hedef RBP'leri içeren bir çözelti içinde yeniden süspanse edin ve çalkalama altında inkübe edin.

Hedef RBP'ler, ARE dizisini tanıyan ve RNA'ya bağlanan RNA tanıma motiflerine sahiptir, böylece boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirilmiş bir RNA-protein kompleksi oluşturur.

Manyetik alan altında boncuklar, prot