Afinite Ekstraksiyonu Yoluyla RNA Bağlayıcı Proteinleri İzole Etmek için RNA-Protein Pull-Down Testi

RNA bağlayıcı proteinleri veya RBP'leri izole etmek için - transkripsiyon sonrası düzenleyiciler - adenilat-üridilat açısından zengin bir element veya ARE - hedef RBP'ler tarafından tanınan bir dizi içeren küçük RNA problarının bir süspansiyonunu alın. RNA probları, bir biyotin türevi olan desthiobiotin ile etiketlenmiştir.

Biotin için afinitesi olan bir protein olan streptavidin ile kaplanmış manyetik boncuklar ekleyin. Boncukların çökelmesini önlemek için çalkalama altında inkübe edin. Desthiobiotin etiketli RNA, streptavidine bağlanır, böylece RNA'yı boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirir.

Manyetik alanın altında, boncuklar tüpün yan tarafında toplanır. Süpernatanı çıkarın. RBP-RNA bağlanması için optimum bir pH sağlayan boncukları bir tampon içinde yeniden süspanse edin.

Mıknatısa maruz kaldığında, boncuklar tüpün yan tarafında toplanır. Süpernatanı atın. Boncukları hedef RBP'leri içeren bir çözelti içinde yeniden süspanse edin ve çalkalama altında inkübe edin.

Hedef RBP'ler, ARE dizisini tanıyan ve RNA'ya bağlanan RNA tanıma motiflerine sahiptir, böylece boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirilmiş bir RNA-protein kompleksi oluşturur.

Manyetik alan altında boncuklar, protein-RNA etkileşimlerini bozmadan mıknatısa doğru hareket eder. Süpernatanı atın. Boncukları biyotin içeren bir elüsyon tamponunda yeniden süspanse edin.

Biyotin, streptavidin'e rekabetçi bir şekilde bağlanarak desthiobiotin'i boncuklardan uzaklaştırır, böylece protein-RNA kompleksini ayrıştırır.

Protein-RNA etkileşimlerini doğrulamak için elüattaki hedef RBP'lerin varlığını değerlendirin.

50 pikomol RNA başına 50 mikrolitre streptavidin-manyetik boncuk önceden yıkayın. Tüpü streptavidin-manyetik boncuklarla 15 saniye boyunca vorteksleyin. Hızlı bir şekilde girdap yaptıktan sonra, kesilmiş pipet uçlarını kullanarak 200 mikrolitreyi 1,5 mililitrelik temiz bir güvenli kilit tüpüne çıkarın. Ardından, boncuklar tüpün yanında toplanacak şekilde tüpü manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve bir dakika bekleyin. Yeniden süspansiyon sıvısını çıkarın.

Boncukları yıkamak için, tüpü 400 mikrolitre 0.1 molar sodyum hidroksit, 0.05 molar sodyum klorür çözeltisinde manyetik standdan çıkarın ve birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Tüpü manyetik standa geri yerleştirin ve bir dakika bekleyin, ardından süpernatanı toplayın.

Boncukları 200 mikrolitre 100 milimolar sodyum klorür ile yıkayın ve süpernatanı çıkarın. 200 mikrolitre 20 milimolar Tris ekleyin. Pipetleme ile boncukları yeniden süspanse edin ve tüpü manyetik standın üzerine yerleştirin. Bir dakika sonra süpernatanı çıkarın. Daha sonra, tüpü 200 mikrolitre 1x RNA yakalama tamponunda manyetik standdan çıkarın ve kısa bir süre girdaplayarak streptavidin-manyetik boncukları yeniden süspanse edin.

50 mikrolitre streptavidin-manyetik boncukları çıkarın ve kesilmiş bir pipet ucu kullanarak her etiketli RNA tüpüne ekleyin. Tüpleri bir rulo üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Tüp bir dakika boyunca manyetik stand üzerinde kaldıktan sonra, süpernatanı çıkarın. Boncuklara 50 mikrolitre 20 milimolar Tris ekleyin ve tekrar süspanse edin. Ardından, tüpleri manyetik standa yerleştirin. Bir dakika sonra süpernatanı çıkarın.

Boncuklara 100 mikrolitre 1x protein-RNA bağlayıcı tampon ekleyin ve tekrar süspanse edin. Ardından, tüpleri manyetik standa geri yerleştirin. Tüpler 1 dakika boyunca standda kaldıktan sonra süpernatanı toplayın. 100 mikrolitre ana karışım ekleyin B. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın ve kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Reaksiyon tüplerini bir silindir üzerinde 4 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin.

Yıkama ve elüsyon adımlarına geçin. Tüpleri manyetik bir standa yerleştirin. Akışı toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. Boncukların üzerine 100 mikrolitre 1X yıkama tamponu pipetleyin. Yavaşça yeniden askıya alın. Onları tekrar standa yerleştirin. Bir dakika bekleyin ve süpernatanı atın. Adımı iki kez tekrarlayın.

Manyetik boncuklara 40 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve bir tüp çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Tüpleri manyetik bir standa yerleştirin, bir dakika bekleyin ve eluat numunesi alın. Buzun üzerine yerleştirin ve aşağı akış analizi için kullanın.