Çözeltideki protein-lipid etkileşimlerini incelemek için mikro ölçekli termoforez

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

0 görüntüleme • 3:43 dk • July 8th, 2025

Proteinlerin lipid molekülleri ile etkileşimini incelemek için iki kılcal tüp ile başlayın. Her iki tüpte floresan boya etiketli test proteinleri ve bunlardan birine etiketlenmemiş lipid molekülleri ekleyin. Bu kılcal damarları bir diziye yerleştirin ve mikro ölçekli bir termoforez aletinin içine yerleştirin.

Protein içeren kılcal damarı odaklanmış kızılötesi ışıkla ışınlayın, odak noktasında çözelti boyunca yayılan bir sıcaklık artışı oluşturun ve floresan etiketli proteinler içeren dar bir bölge içinde bir sıcaklık gradyanı oluşturun.

Floresan dedektörü, floresan sinyalini, lazerin odaklandığı kılcal damarın aynı noktasından toplar. İşlemci sinyali dönüştürür ve zamanın bir fonksiyonu olarak bağıl floresanın bir grafiğini oluşturur.

Bir sıcaklık gradyanında, etiketli proteinler daha sıcak bölgeden daha soğuk bölgeye göç etmeye başlar ve sıcaklığa bağlı bir göç olgusu olan termoforez sergiler.

Termoforez nedeniyle, floresan yoğunluğu zamanla kademeli olarak azalır ve etiketli proteinlerin dengeye ulaştığı kararlı bir duruma ulaşır.

Protein-lipit karışımı içeren kılcal damarı ışınlayarak bir sıcaklık gradyanı oluşturun.

Termoforez sırasında, göç eden etiketli proteinler, lipid molekülleri ile etkileşime girerek daha yüksek moleküler kütlelere sahip lipit-protein kompleksleri oluşturur. Bu, hareketlerinin gecikmesine yol açar.

Bu diferansiyel göç, floresansta bir kaymaya neden olarak başarılı protein-lipit etkileşimini doğrular.

Bir analize başlamadan önce, MST cihazının arkasındaki güç anahtarını açın ve kontrol yazılımını açın. Bilgisayarın aygıta bağlı olduğunu ve "Bağlı" durumda olduğunu onaylayın ve MST Önce'yi 3 saniyeye, MST'yi 30 saniyeye ve Floresan Kurtarma'yı 1 saniye sonrasına ayarlayın.

Her kılcal boru için, otomatik doldurma titrasyon oranını kullanarak hedef ligandın adını, ligand analitinin adını, hedefin konsantrasyonunu ve en yüksek titrasyon konsantrasyonunu girin. Bir dizi MST gücü seçin ve en sağlam bağlama uyumunu test etmek için her bir güç için değerleri girin.

Etiketli MST numunelerini hazırlamak için, her ikisi de PBS'de olmak üzere bir Vam7-oktahistidin çözeltisini 200 nanomolar konsantrasyona ve bir NTA-Atto 647 boyasını 100 nanomolar konsantrasyona seyreltin. Vam7-oktahistidin ve NTA-Atto 647 boyasını 1'e 1 hacimsel oranda karıştırın ve karışımın 30 dakika boyunca ışıktan korunarak oda sıcaklığında oturmasına izin verin. İnkübasyonun sonunda, boya ve protein karışımını santrifüjleyin ve çözeltiyi kullanmadan önce birkaç saate kadar 4 santigrat derecede saklayın. Ardından numuneyi hazırlayın. Boyayı liganda alın ve analiti açığa çıkarın.

Numunenin Mikro Ölçekli Termoforezi için cihazı açın ve kılcal rafı dışarı kaydırın. Numune kılcal damarlarını 1 konumunda en yüksek konsantrasyona sahip rafa yükleyin ve kontrol yazılımında kırmızı kanalı seçin. Ardından, rafı cihaza yükleyin. Ardından, bir MST gücü aralığı seçin ve Cap Scan + MST ölçümünü başlatın ve kaydırma yanıtını değerlendirin.

08:09

Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:11

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:26

Floresan Etiketli Proteinlerin Yapay Fosfolipid Mikrovezikülleri ile Etkileşiminin Kantitatif Akış Sitometrisi Kullanılarak Analiz Edilmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:04

Cilt Mekanizmaları belirleme Sipariş Değişken konsantrasyon İzotermal Titrasyon Kalorimetre Veri Kümeleri toplanıyor

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:36

Protein-Lipid Çift Tabaka Etkileşimini İncelemek için Dağıtıcı Mikrogravimetri Tekniği

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:22

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

İlgili videolar

0 Görüntüler

13:26

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:28

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:22

Protein dengelemek nasıl: istikrar ekranlar için termal kayması deneyleri ve Nano diferansiyel Fluorimetry virüs-X projede tarama

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:45

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 29 Ağustos 2026