JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 3:36 dk • July 8th, 2025
Enerji tüketen mikrogravimetri yoluyla bir fosfolipid bağlayıcı protein ile bir lipid çift tabakası arasındaki etkileşimi incelemek için kuvars sensörlü bir mikro terazi alın. Uygun bir voltaj uygulandığında, iki metal elektrot arasına sıkıştırılmış kuvars tabakası belirli bir frekansta salınır.
Sensörün üzerine, tek bir lipid çift tabakasından oluşan küçük unilamellar veziküllerden oluşan bir süspansiyon ekleyin. Veziküller, silika kaplı hidrofilik yüzey üzerinde adsorbe olur - sensör kütlesini arttırır ve salınım frekansını orantılı olarak azaltır.
Tampon dolgulu veziküller, viskoelastik bir tabaka görevi görür ve dağılmaya yol açar - salınımın sönümlenmesi. Adsorbe edilen veziküller yırtılır ve kapalı tamponu serbest bırakır. Sonuçta ortaya çıkan kütle azalması salınım frekansını arttırır.
Yırtılmış veziküller, biyolojik bir zarı taklit eden sürekli bir çift tabaka oluşturur. Çift tabakanın sertliği dağılımı azaltır.
Hedef proteinle birlikte kalsiyum iyonları içeren bir tampon ekleyin. Kalsiyum iyonları proteine bağlanır ve konformasyonunu değiştirir - çift tabakadaki lipit moleküllerine bağlanmayı sağlar.
Protein bağlanması, sensörün kütlesini artırır ve frekansın azalmasına neden olur. Çift tabakanın yapısal bütünlüğü etkilenmeden kalır - dağılımda sadece hafif bir artışa neden olur.
Kalsiyum iyonlarını şelatlamak için bir kenetleme maddesi ekleyin - proteinleri iki tabakadan ayırın.
Bağlı proteinlerin yokluğu, salınımın sıklığını ve dağılımını proteine bağlı olmayan seviyelere geri döndürür - bağlanmanın yalnızca kalsiyuma bağımlı olduğunu ve çift tabakanın bozulmadan kaldığını doğrular.
Plazma ile temizlenmiş sensörleri cımbız kullanarak dört akış odasına dikkatlice yerleştirin. Sızıntıya neden olabilecek hazneler ve tüpler üzerinde herhangi bir baskı veya burulmadan kaçının. Sistemi açık akış modunda sitrat tamponu ile 10 dakika yıkayın.
Programı başlatın. Frekans ve dağılım taban çizgileri sabit olana kadar yazılımı kullanarak ilk temel tonun ve üst tonların frekansı ve dağılımındaki değişiklikleri kaydetmeye başlayın.
Taban çizgileri sabit olduğunda, SUV süspansiyonunu sitrat tamponuna uygulayın. Bir reaksiyon kabı kullanarak, ölü hacmin 1,5 mililitresini çıkarın. Ardından, sistemi döngü akış modunda kapatın. Frekans dağılımı kaymasını 10 dakika daha kaydedin.
SLB stabil olduğunda, sistemi 40 dakika boyunca açık akış modunda gerekli kalsiyum konsantrasyonlarında çalışan tampon ile dengeleyin. Proteini kalsiyum içeren çalışan tampona ekleyin. Proteinin uygulamasını, kararlı bir denge durumuna ulaşılana kadar bir döngü akış modunda gerçekleştirin.