DNA perdeleri üzerinde füzyon proteini kondensatlarının montajını görselleştirmek için tek moleküllü görüntüleme

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

0 görüntüleme • 4:06 dk • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir kimerik onkojenik füzyon proteini, bir transkripsiyon faktörü proteininin DNA bağlama alanı, DBD ile kaynaşmış bir RNA bağlayıcı proteinin N-terminal düşük karmaşıklık alanını, LCD'yi içerir. Bu proteinler, RNA polimeraz-II'yi işe alan ve onkogenezi yönlendiren bir protein kondensatı oluşturur.

Tek moleküllü görüntüleme ile protein kondensatlarının montajını görselleştirmek için, bir DNA akış hücresi ile başlayın - giriş ve çıkış enjeksiyon portları ile donatılmış kaynaşmış bir silika cam slayt. Akış hücresinin yüzeyi, yüzeyi korumak için biyotinile edilmiş bir lipid çift tabakası ile kaplanır ve zikzak bir bariyer ile üretilir.

Mikroakışkan bir sisteme bağlayın. Lipid tabakası üzerindeki yüksek bağlayıcı afiniteye sahip ligandı biotin'e bağlanan bir streptavidin çözeltisi ekleyin. Füzyon proteini bağlama dizilerinin çoklu tekrarlarını içeren biyotin etiketli çift sarmallı lambda DNA'sı enjekte edin. Lipid çift tabakasının streptavidini, DNA'nın biyotinine bağlanır ve lambda DNA'sını çift tabakaya bağlar.

Uygun bir tamponla yıkayın. Akışının hidrodinamik kuvveti, sabitlenmiş DNA moleküllerini düzleştirir ve bariyerlerin üzerinde DNA perdeleri olarak asılı kalmalarını sağlar.

Akış hücresini bir floresan mikroskobu altına yerleştirin. DNA bağlayıcı yeşil floroforlardan oluşan bir çözelti enjekte edin. Daha sonra, LCD alanı aracılığıyla protein bağlayıcı macenta florofora etiketlenmiş bir füzyon proteini çözeltisi enjekte edin ve inkübe edin.

Etiketli füzyon proteinleri, DNA'nın uzunluğu boyunca kondensatlar oluşturmak için lambda DNA'sı üzerindeki hedef diziye bağlanır. Uyarılma üzerine, DNA'ya bağlı ve proteine bağlı floroforlar floresan verir.

Füzyon proteini kondensatları, yeşil floresan etiketli çift sarmallı DNA üzerinde macenta renkli punkta olarak görünür.

DNA perdeleri üzerinde EWS-FLI1 yoğunlaşma oluşumunu görüntülemek için görüntüleme yazılımını açın ve parlak alan altında dokuz zikzak desenin konumlarını bulun ve işaretleyin. Ardından, DNA'yı 10 dakika boyunca çift sarmallı DNA boyası ile boyamak için akışı dakikada 0,2 mililitrede açın.

Daha sonra, mCherry-EWS-FLI1 proteinini 100 nanomol ve 100 mikrolitre konsantrasyonda görüntüleme tamponu ile seyreltin. Ardından, protein örneğini 100 mikrolitrelik bir cam şırınga ile valften yükleyin ve akış hızını dakikada 0,4 mililitre olarak değiştirin.

488 nanometre lazeri açtıktan sonra, DNA dağılım durumunu kontrol etmek için her bölgeyi önceden tarayın ve DNA moleküllerinin eşit olarak dağıldığı bölgeyi seçin. Ardından, lazer gücünü 10 nanometre lazer için %488 ve 20 nanometre lazer için %561 olarak ayarlayın ve güç ölçeri kullanarak prizmanın yakınındaki gerçek lazer gücünü ölçün.

Aynı

anda hem 488 hem de 561 nanometre lazerlerle iki saniyelik aralıklarla görüntü almaya başlayın. Ardından, görüntüleme tamponunun protein örneğini 60 saniye sonra akış hücresine akıtmasına izin vermek için valfi manuel moddan enjeksiyon moduna değiştirin.

Serbest EWS-FLI1'i çıkarmak için, yalnızca 561 nanometre lazer açıkken akış hücresini görüntüleme tamponuyla beş dakika boyunca yıkamaya devam edin. Ardından akışı durdurun ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.

10 dakika sonra, DNA'nın uzamasına izin vermek için akışı dakikada 0,4 mililitre olarak açın ve EWS-FLI1 kondensat oluşumunun yüksek verimli verilerini elde etmek için farklı çerçeveler arasında iki saniyelik aralıklarla görüntüler elde edin.

12:05

Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:28

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:20

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

İlgili videolar

0 Görüntüler

14:36

Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

İlgili videolar

0 Görüntüler

14:43

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:27

Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

13:10

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:05

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:32

Histon Düzeneğinin Moleküler Mekanizmasının DNA Perde Tekniği ile Deşifre Edilmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:48

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 15 Ağustos 2026