Protein-Fosfoinositid Etkileşimlerini Tespit Etmek için Desteklenen Lipid Çift Katmanları Üzerinde pH Modülasyon Testi

Fosfatidilinositol 4,5-bifosfat veya PIP2, zara bağlı küçük bir fosforile fosfolipiddir. Spesifik PIP2 bağlama alanlarına sahip fosfolipaz C veya PLC, PIP2'ye bağlanır ve birkaç hücresel süreç için gerekli olan ikincil haberciler üretir.

PLC-PIP2 etkileşimlerini in vitro olarak tespit etmek için, biri pH'a duyarlı bir floresan boyaya konjuge edilmiş PIP2 ve fosfolipid karışımını içeren küçük bir unilamellar vezikül, SUV, asidik süspansiyon ile başlayın.

Çözeltiyi önceden monte edilmiş fabrikasyon bir mikroakışkan cihazın girişine pipetleyin ve çıkış borusunu bağlayın. Cihazı bir floresan mikroskobu aşamasına aktarın ve sabitleyin. Yerçekimi yoluyla, SUV'lar hidrofilik bir cam lamelden yapılmış mikrokanal tabanından geçer.

SUV'lar cam yüzeyde adsorbe olur, çözeltinin pH'ı ikisi arasındaki elektrostatik itmeyi düşürür. SUV'lar yüzeyle etkileşime girer, deforme olur ve büyük veziküller oluşturmak için kaynaşır.

Kritik yüzey kaplamasını takiben, veziküller kendiliğinden yırtılır ve desteklenen bir lipid çift tabakası olan SLB'yi oluşturur. Adsorbe edilmemiş vezikülleri çıkararak kanaldan bir tampon geçirin.

Uygun bir floresan kanalı kullanarak, SLB'deki pH'a duyarlı boya floresansını (düşük pH'ta yüksek floresan ) görselleştirmek ve ölçmek için mikro kanalı görüntüleyin.

Mikrokanala rekombinant bir PLC çözümü ekleyin. Çözeltinin PLC'nin izoelektrik noktasının altındaki nötr pH'ı, PLC'yi pozitif yüklü hale getirir.

PIP2 bağlama alanına sahip rekombinant PLC, PIP2'ye bağlanır ve negatif yüklü hidroksit iyonlarını iki katmanlı yüzeye çeker. Bu, iki katmanlı yüzeyi daha temel hale getirir, boyanın protonasyon durumunu değiştirir ve floresan söndürmeye neden olarak PLC-PIP2 etkileşimlerini gösterir.

Küçük unilamellar veziküller içeren fosfatidil inositol-4 5-bifosfatın 100 mikrolitresini 0.65 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 6,4 mikrolitre 0,2 Normal hidroklorik asit ekleyerek çözeltinin pH'ını yaklaşık 3,2'ye ayarlayın.

PH ayarlı küçük unilamellar vezikül solüsyonundan 10 mikrolitre pipetleyin ve solüsyon çıkışa ulaşana kadar pipetten basınç uygulayın. Ucu pipetten ayırın ve cihaza takılı bırakın. Her kanal için bu adımı tekrarladıktan sonra, cihazı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Veziküllerin mikrokanallara enjeksiyonu, cihaz montajından hemen sonra yapılmalıdır. Bu arada, giriş ve çıkış borularını kesin. Cımbız kullanarak çıkış hortumu setini cihaza bağlayın ve ardından cihazı bir mikroskop tablasına bantlayın.

Giriş borusu setinin bir ucunu konik bir tüpte bulunan 25 mililitre çalışma tamponuna batırın ve borunun sabitlendiğinden emin olmak için bantlayın. Bir laboratuvar jakı kullanarak, çözeltiyi yerçekimi akışı yoluyla mikro kanallardan itmek için konik boruyu cihazdan daha yüksek bir yere yerleştirin.

Her giriş tüpü için, borunun serbest ucundan 1 mililitre çalışma tamponu çekmek için bir şırınga kullanın. Pipet ucunu girişten çıkarın ve giriş borusunun serbest ucunu cihaza yerleştirin. Tüm giriş borusu parçalarını cihaza bağlamak için bu işlemi tekrarlayın. Kanallar boyunca akan akan tampon, fazla yırtılmamış veziküllerin çıkarılmasına ve çift tabakanın deneysel koşullara dengelenmesine yardımcı olur.

Ardından, mikroskop kontrol yazılımını açın. Sol panelde, "Mikroskop" sekmesine tıklayın ve "10x" hedefini seçin. "Canlı"ya ve ardından araç çubuğundaki "Alexa 568" görüntü simgelerine tıklayın. İnce ve Kaba ayar düğmelerini kullanarak mikro kanallara odaklanın. SLB'lerin ve kanalların kalitesini kontrol etmek için cihazı tarayın.

Ardından, araç çubuğundaki "FL Shutter Closed" görüntü simgesini tıklayın. "Edinme" sekmesine tıklayın ve "Temel Ayarlamalar" altında pozlama süresini seçin. Pozlama süresini 200 milisaniye olarak ayarlayın. Sol panelde, "Çok Boyutlu Edinim" üzerine tıklayın. "Filtreler" menüsü altında kırmızı kanalı seçin. Ardından, "Hızlandırılmış" menüsüne tıklayın. Zaman aralığını 5 dakikaya, süreyi 30 dakikaya ve atlama menüsünü ayarlayın.

"Ölç" sekmesi altındaki "Daire" aracını seçin ve herhangi bir kanalda bir daire çizin. Daire seçiliyken sağ tıklayın ve "Özellikler" i seçin. "Profil" sekmesi altında, floresan yoğunluğunu zamanın bir fonksiyonu olarak görüntülemek için "tüm T"yi işaretleyin. Bir sonraki adıma geçmeden önce bu eğrinin dengeyi gösteren bir platoya ulaştığından emin olun.

Akışı durdurmak için tampon çözeltisini cihazla eşit bir toprağa indirin. Her seferinde bir tane, her bir çıkış borusunu ayırın ve bir pipet kullanarak çıkış kanalına her protein seyreltmesinden 200 mikrolitre uygulayın. Herhangi bir baskı uygulamayın. Bırakın işi yerçekimi yapsın. Ucu pipetten ayırın ve mikroakışkan cihaza bağlı bırakın. Bu işlemi her kanal için tekrarlayın ve bu işlem sırasında kanallara hava kabarcıklarının girmediğinden emin olun.

Ardından, proteini mikro kanallardan akıtmaya başlamak için giriş borusunu mikroakışkan cihazın altındaki bir toprağa indirin. Borunun serbest ucunu bir atık kabına bantlayın. Pleckstrin homoloji alanının dilüsyonlarını 30 dakika boyunca akıtın. Yazılımın sol panelinde, "Hızlandırılmış Çekim" sekmesi altında, yeniden görüntülemeye başlamak için "Başlat"a tıklayın.