Protein Oligomerleri için Çok Açılı Işık Saçılımlı Boyut Dışlama Kromatografisi

Bir protein oligomeri, daha büyük bir fonksiyonel birim oluşturmak için birbirine bağlanan çoklu protein alt birimlerinden oluşan bir komplekstir.

Protein monomerlerinin ve bunların oligomerlerinin çözelti içindeki moleküler ağırlığını, boyut dışlama kromatografisi ve çok açılı ışık saçılımının bir kombinasyonu olan SEC-MALS ile belirlemek için, bir boyut dışlama kromatografisi veya SEC sütunu ile başlayın.

Sütun, içlerinde daha küçük boyutlu molekülleri yakalayan gözenekli elek benzeri küresel jel boncuklar içerir. Sütunu, proteinin doğal durumuyla uyumlu bir tampon ile dengeleyin.

Kolonun üst kısmına protein monomerleri ve oligomerleri içeren bir numune yükleyin.

Akış sırasında, oligomerler kolonun parçacıklar arası boşluğundan geçerken, monomerler boncukların gözenekleri içinde sıkışıp kalır. Bu, daha büyük boyutlu protein oligomerlerinin daha küçük boyutlu monomerlerden daha hızlı hareket etmesine neden olur.

Hızlı salınımlı oligomerleri ve ardından yavaş salınımlı monomerleri MALS dedektörüne yönlendirin.

Dedektörden geçerken, farklı açılarda dağılmış bir lazer ışığı onları aydınlatır. Çok alt birimli oligomerler, monomerden daha fazla ışık saçar.

Saçılan ışığın çoklu açılardaki yoğunluğu, protein oligomeri ve monomerinin moleküler ağırlığı ile doğru orantılıdır.

Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi SEC-MALS sisteminin hazırlanması ile başlayın. HPLC dereceli reaktifler kullanarak, 50 ila 100 mililitre sodyum klorür ile bir litre fosfat tamponlu salin hazırlayın. Şişe üstü polieter sülfon filtresi veya benzerini kullanarak tamponu 0,1 mikrona kadar filtreleyin.

Kuru filtrelerdeki partikülleri gidermek için ilk 50 ila 100 mililitre tamponu bir atık şişesine filtreleyin. Ardından, kalanını daha önce filtrelenmiş, deiyonize su ile yıkanmış ve tozun girmesini önlemek için tutulmuş temiz, steril bir şişeye süzün.

Tampondaki sütunu dengelemek ve partikülleri gidermek için sütunu gece boyunca dakikada 0,5 mililitre akış hızında yıkayın. FPLC'nin "Sürekli akış" modunu kullanın ve tüm SEC-MALS çalıştırmaları tamamlanana kadar akışın durmadığından emin olun. Gece yıkama sırasında dRI akış hücresini boşaltma moduna alın.

Yıkamaya başlarken, kolondaki ani basınç değişikliğinin neden olduğu "kolon dökülmesi" etkisini önlemek için akış hızını kademeli olarak artırın. Örnek çalıştırmalarına başlamadan önce tahliyeyi kapatın.

Biriken parçacıkları serbest bırakmak için kolonun aşağı akışındaki boruya hafifçe vurarak sistem temizliğini kontrol edin. MALS cihazının ön panel ekranındaki 90 derecelik dedektördeki sinyali gözlemleyin. Tepeden tepeye gürültünün 50 ila 100 mikrovolttan fazla olmadığını doğrulayın. Ayrıca, kırılma indisi veya RI sinyalinin 1 x ^10-7 kırılma indisi biriminden daha azına kadar kararlı olduğunu doğrulayın.

Enjektörün parçacıklardan arınmış olduğunu doğrulamak için 'boş' bir enjeksiyon yapın. 'Boş' basitçe taze steril bir şişede hazırlanan çalışma tamponudur. Parçacık tepe noktası hacim olarak 1 mililitreden fazla değilse ve taban çizgisinin üzerinde 5 milivolttan fazla değilse, sistem numuneler için hazırdır. Aksi takdirde, temizleyene kadar ek boş enjeksiyonlar yapın veya enjektörü temizlemek için bakım yapın.

Şimdi, SEC tamponunda mililitre başına 1 ila 2 miligram arasında en az 200 mikrolitre BSA hazırlayın. Bir şırınga ucu filtresi kullanarak proteini 0.025 mikrona kadar filtreleyin. Kuru filtrelerdeki partikülleri ortadan kaldırmak için ilk birkaç damla süzüntüyü atın. Alternatif olarak, çözünmeyen agregaların ve diğer büyük partiküllerin çökelmesini sağlamak için numuneyi 15 dakika boyunca 10.000 kez g'da santrifüjleyin. Ardından, döngüye 100 mikrolitre BSA çözeltisi enjekte edin.