DNA Aptamer-Terponabil Ligand Etkileşimini İncelemek için Diferansiyel Taramalı Kalorimetri

Diferansiyel taramalı kalorimetri, ligandın yokluğunda ve varlığında biyomolekülü denatüre etmek için gereken ısıyı ölçerek biyomolekül-ligand etkileşimlerini incelemeye yardımcı olur.

Başlamak için, serbest DNA aptamerleri (yapılandırılmış tek sarmallı oligonükleotidler) içeren bir referans ve termolabil ligand'a bağlı aptamerler içeren bir örnek alın. Ligandlar, aptamerin ikincil yapısını stabilize eder.

Çözeltileri ısıtarak ileriye doğru bir tarama gerçekleştirin. Erime sıcaklığına ulaşıldığında, serbest aptamerler denatüre olur.

Ligand ile stabilize edilmiş aptamerler ligandlardan ayrışır ve nispeten daha yüksek bir sıcaklıkta denatüre olur, bu da serbest aptamerlere kıyasla erime sıcaklığında bir yükselmeye neden olur. Yüksek sıcaklıklarda, ligandların bir alt kümesi, düşük bağlanma afinitesine sahip geri dönüşü olmayan bir ikincil form elde eder.

Ardından, aptamer yapısını yeniden kazanmak için çözeltileri soğutarak ters bir tarama yapın. Daha düşük sıcaklıkta, numunedeki ilk ve dönüştürülmüş ligandlar aptamerlere bağlanır.

İkinci ileri tarama sırasında, dönüştürülen ligandlara zayıf bir afinite ile bağlanan aptamerler, ilk ligand'a bağlı aptamerlerden daha düşük bir sıcaklıkta ayrışır ve denatüre olur, bu da erime sıcaklığında bir düşüşe neden olur.

Ardışık taramalarla, ligandlar ikincil forma dönüşmeye devam eder ve bu da ilk formun tamamen tükenmesine neden olur. Termogramı edinin.

Her taramada, ligand'a bağlı aptamerin erime sıcaklığı serbest aptamere doğru kayar ve bu da ikincil formun zayıf bağlanma afinitesini gösterir.

Diferansiyel taramalı kalorimetreye veya DSC'ye yüklemeden önce tampon, biyomolekül ve ligand çözeltilerinin gazını bir masa üstü gaz gidericide boşaltın. Basınç kolunu DSC'den sökün. Ardından, çalışma tamponundan silikon boruyu çalıştırın ve referans kılcal damarın ön flanşına takın.

Arka referans flanşını ön numune flanşına bağlayarak referans ve numune kılcal damarları arasında bir köprü oluşturun. Ardından, bir vakum hattı takılı bir atık şişesine giden arka numune flanşına bir parça silikon boru takın. DSC'yi 200 mililitre çalışma tamponu ile yıkamak için vakum hattını açın.

Referans kılcal flanşlara yaklaşık 3 ila 5 santimetrelik silikon boru bölümleri takarak başlayın. Ardından, arka flanşın silikon borusuna 1 mililitrelik bir pipet ucu yerleştirin. Bir pipetle 0,8 mililitre çalışma tamponu çizin ve tamponlu pipet ucunu ön referans flanşının silikon borusuna yerleştirin.

Çalışma tamponunu ön silikon borudan referans kılcal damara ve arka flanşın takılı pipet ucuna geçirmek için pipet pistonunu yavaşça aşağı doğru bastırın. Çalışma tamponu seviyesi ön silikon borunun hemen üzerine ulaşana kadar pipet pistonunu aşağı doğru bastırın. Ardından, çalışma tamponu seviyesi arka silikon borunun hemen üzerine ulaşana kadar pipet pistonunu serbest bırakın. Kabarcıkların hacmini temizlemek için çalışma tamponunu referans kılcal damarda ileri geri geçirmeye devam edin.

Ardından, arka pipet ucunu işaret parmağınızla kapatın ve silikon boru takılıyken referans flanşlarından çıkarmak için arka pipet ucunu ve ön pipeti yavaşça yukarı çekin. Numune kılcalını daha önce olduğu gibi çalışma tamponu ile yükleyin.

Arka referans ve numune flanşlarına siyah plastik bir kapak yerleştirin ve ön flanşları açıkta bırakın. Basınç kolunu DSC'ye takın ve ardından DSC yazılımını açın ve güç okuması stabilize olduktan sonra arayüzün üst kısmındaki kırmızı "Yukarı" oka tıklayarak cihaza basınç uygulayın. DSC gücü, cihaz sıcaklığı ve basınç okuması ile birlikte arayüzün sağ üst köşesindeki bir kutuda gösterilir.

İleri ve geri tarama yaparak DSC'yi çalışma arabelleği ile dengeleyin. Ekranın sol tarafındaki "Deneysel Yöntem" sekmesinde, DSC'yi sıcaklık tarama modunda çalıştırmak için "Tarama" seçeneğinin seçili olduğundan emin olun.

"Deneysel Yöntem" sekmesi altındaki "Sıcaklık parametreleri" ekinde, ısıtma düğmesine tıklayın. Alt ve üst deney sıcaklıkları için 1 ve 100 santigrat derece, tarama hızı için dakikada 1 santigrat derece ve dengeleme süresi için 60 saniye girin. Dengeleme periyodu için giriş alanının altındaki "Seri Ekle" düğmesine tıklayın. Açılır penceredeki "Eklenecek adımlar " alanına 2 girin ve "Alternatif Isıtma/Soğutma" kutusunu işaretleyin. "Tamam" ı tıklayın.

Eklenen taramalar arayüzün alt kısmında görünür. Her tarama için parametrelerin istendiği gibi olup olmadığını kontrol edin. Arayüzün üst kısmındaki yeşil "Oynat" düğmesine tıklayarak denemeyi başlatın. İstediğiniz pencereye gidin ve açılır pencereye denemeyi kaydetmek için bir dosya adı girin. "Deneme Yöntemi" sekmesinin sağındaki "Veri" sekmesini tıklayarak deneme ilerlemesini görüntüleyin.

DSC'yi her iki kılcal damarda çalışma arabelleği ile yeniden yükleyerek örnek verilerin temel çıkarılması için referans deneyleri çalıştırın. 120 saniyelik bir üst dengeleme süresi ile dakikada 1 santigrat derece ile uygun bir sıcaklık aralığında birden fazla ileri ve geri tarama toplayın.

Önceki arabellek dengeleme taramalarını, her birini ayrı ayrı vurgulayarak ve arayüzün sağ ortasındaki kırmızı "X" işaretine tıklayarak arayüzün alt kısmından silin.

"Seri Ekle" düğmesine tıklayarak, "Eklenecek adımlar " alanına 20 girerek ve "Alternatif Isıtma/Soğutma" kutusunu işaretleyerek yeni taramaları ekleyin. Ardından, "Tamam" ı tıklayın ve daha önce olduğu gibi yeşil "Oynat" düğmesini tıklayarak denemeyi çalıştırın.

Ligand için referans deneyleri elde etmek için her iki kılcal damarda istenen ligand konsantrasyonunu içeren çalışma tamponu ile bu adımları tekrarlayın. Termorebil ligand dönüşümü için hız sabitini elde etmek için kullanılacak iki ayrı deney toplayın.

Serbest biyomolekül veri seti için, referans kılcalın çalışma tamponunu içerdiğinden, numune kılcalının ise çalışma tamponunda istenen konsantrasyonda serbest biyomolekülü içerdiğinden emin olun. Ardından, referans taramalarında kullanılan aynı DSC yükleme prosedürünü ve deneysel parametreleri kullanarak örnek deneyleri çalıştırın.

Ligand'a bağlı deneyler için, ligandın referans kılcaldaki çalışma tamponunda ve biyomolekül artı ligandın numune kılcalındaki çalışma tamponunda olduğundan emin olun. Sistemi daha önce olduğu gibi farklı ligandların ilaveleri arasında yıkayın.

Yüksek sıcaklık dengeleme süresinin 600 saniyeye çıkarıldığı ve diğer tüm deneysel parametrelerin öncekiyle aynı olduğu termolabil liganda bağlı biyomolekül ile ek bir deney yapın. Metin protokolünde açıklandığı gibi veri işleme ve analizine devam edin.