Reseptör-ligand etkileşimlerini bozan bileşikleri tanımlamak için rekabetçi bağlanma testi

Rekabetçi bağlanma testi, bir hedef reseptöre rekabetçi bir şekilde bağlanarak ve doğal ligand bağlanmasını inhibe ederek reseptör-ligand etkileşimlerini bozan küçük molekülleri tanımlar.

Bir reseptöre özgü küçük molekül antagonistinin varlığında bir reseptörün doğal ligandı ile etkileşimlerini tanımlamak için, hedef reseptörü eksprese eden insan T-lenfosit hücrelerinin bir süspansiyonu ile başlayın.

Hücre süspansiyonunu, artan antagonist konsantrasyonları içeren çok kuyulu bir plakanın kuyucuklarına ekleyin. Kuluçkaya yatmak. Antagonist, reseptörün doğal ligand bağlanma bölgesi olan ortosterik bağlanma bölgesine bağlanır.

Kuyucuklara sabit bir konsantrasyonda floresan etiketli doğal ligand ekleyin. Kuluçkaya yatmak.

Düşük konsantrasyonlarda, antagonistler az sayıda ortosterik bağlanma bölgesi işgal eder ve reseptörlere doğal ligand bağlanmasına izin verir. Bununla birlikte, daha yüksek konsantrasyonlarda, antagonistler ortosterik bağlanma bölgelerinin çoğunu işgal eder ve minimal doğal ligand-reseptör bağlanmasına izin verir.

Hücreleri peletlemek için santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Hücresel morfolojiyi koruyarak hücreleri sabitlemek için paraformaldehit içinde yeniden süspanse edin.

Bir akış sitometresi kullanarak, antagonist ve floresan ligandına bağlı reseptörleri eksprese eden tek tek T-lenfositlerden gelen floresan sinyallerini analiz edin.

Artan reseptöre özgü antagonist konsantrasyonları ile ortalama floresan yoğunluğundaki doza bağlı bir azalma, antagonistlerin ortosterik reseptör bağlanma bölgelerine rekabetçi bağlanmasını gösterir ve doğal ligand-reseptör etkileşimini inhibe eder.

Başlamak için, 100 mikrolitre bileşik çözeltiyi, önceden tanımlanmış bir deney düzenine göre 96 oyuklu şeffaf bir yuvarlak tabanlı plakaya dağıtın.

Çok kanallı bir pipet kullanarak bir reaktif rezervuarından 50 oyuklu plakaya 96 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, benzer bir reaktif rezervuarından 96 oyuklu plakanın kuyucuklarına mililitre CXCL12 başına 50 mikrolitre floresan etiketli 100 nanogram ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, 96 oyuklu plakayı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca yerçekiminin 400 katı sıcaklıkta santrifüjleyin. Plakayı ters çevirerek süpernatanı peletlenmiş hücrelerden çıkarın. Plakayı bir mendil üzerinde kurutun. Çok kanallı bir pipet kullanarak bir reaktif rezervuarından kuyucuklara 200 mikrolitre taze tahlil tamponu ekleyin.

Hemen plakayı oda sıcaklığında 400 kat yerçekiminde 5 dakika boyunca tekrar santrifüjlemeye devam edin. Yine, plakayı ters çevirerek ve ardından bir doku üzerinde kurutarak süpernatanı çıkarın. Son olarak, hücre peletini PBS'de çözünmüş 200 mikrolitre% 1 paraformaldehit içinde nazikçe yeniden süspanse edin. Bu adım hücreleri düzeltecektir.

Numuneleri akış sitometrisi ile analiz etmek için cihazı başlatın ve ilgili yazılımı açın. Nokta-leke biçiminde görselleştirilecek hücresel parametreleri ileri saçılma alanı, yan saçılma alanı ve histogram görünümünde florofor algılama kanalı olarak seçin.

İleri saçılma ve yan saçılma parametrelerine dayalı olarak tanımlanmış bir homojen hücre popülasyonunun geçitlenmesini gerçekleştirmek için bir numune, örneğin bir negatif kontrol numunesi seçin. Hücreleri akış sitometri cihazına yüklemek için ayarları uyarlayın.

Enjeksiyondan önce üç karışım seçin. 100 mikrolitre sabitlenmiş hücrenin otomatik enjeksiyonunu seçin ve saniyede 1,5 mikrolitrelik bir numune akış hızı kullanın. "Veri Al"ı seçerek örneği çalıştırın. Bu numune için ileri saçılma ve yan saçılma parametrelerinin yanı sıra florofor algılama artık ekranda görünecektir.

Şimdi, yazılımın geçit aracını seçin. İleri saçılma ve yan saçılma nokta-leke grafiği görselleştirmesine dayalı olarak, geçit ile homojen ve canlı bir hücre popülasyonunu önceden tanımlayın. Örnek başına 20.000 "olayı" analiz etmek için seçin.

Bu, her numune için, önceden tanımlanmış bir kapıya giren 20.000 hücrenin sonunda analiz edileceği anlamına gelir. Bu olay sayısına ulaşılana kadar veri toplama devam edecektir.

Önce analiz edilecek kuyuları seçerek çalıştırmaya başlayın. Ardından, "Kuyuları Çalıştır" ı seçin.

Akış sitometrisi cihazı şimdi, önceden tanımlanmış kapıya giren 20.000 hücreden gelen ortalama floresan sinyaline karşılık gelen her numune için ortalama floresan yoğunluğunu kaydederek bu numuneleri tek tek analiz edecektir.

Son olarak, protokolde açıklandığı gibi veri analizi gerçekleştirin.