JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 3:35 dk • July 8th, 2025
Reseptör-ligand etkileşimlerini incelemek için, yüzeylerinde test ligandlarını eksprese eden hedef hücrelere sahip ortam içeren çok kuyulu bir plaka ile başlayın.
Tasarlanmış fare BW hücreleri ekleyin - zara bağlı kimerik reseptörleri eksprese eden yeni bir B hücresi popülasyonu. Kimerik reseptörler, B hücresi reseptörünün transmembran ve hücre içi sinyal alanına kaynaşmış spesifik bir reseptörün hücre dışı alanını içerir.
Hedef hücrelerdeki ligandlar, BW hücrelerinin kimerik reseptörlerinin hücre dışı alanı ile etkileşime girer ve BW hücrelerinde hücre içi sinyal alanı aktivasyonuna neden olur. Bu, aşağı akış sinyalizasyonunu ve sitokinlerin üretimini tetikler - BW hücrelerinin dışına salınan ve medyada görünen salgı raportör molekülleri.
Plakayı santrifüjleyin. Sitokin içeren süpernatanı, anti-sitokin antikorları ile önceden kaplanmış bir ELISA plakasına aktarın. Sitokinler, antikorların Fab bölgeleri ile etkileşime girerek plaka yüzeyinde immobilizasyonlarına yol açar.
Spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için plakaya bir bloke edici solüsyon uygulayın. Önceden bağlanmış sitokinlerle etkileşime giren ve bağışıklık kompleksleri oluşturan biyotinile anti-sitokin antikorları ekleyin.
Plakayı enzim konjuge bir streptavidin çözeltisi ile kaplayın. Streptavidin bağışıklık kompleksleri üzerinde biyotin ile bağlanır.
Plakaya bir alt tabaka uygulayın. Enzim-substrat etkileşimi, çözeltiye aynı rengi veren renkli bir ürün üretir. Renkli çözelti, başarılı reseptör-ligand etkileşimini gösteren raportör moleküllerin varlığını doğrular.
96 oyuklu bir plakanın tek bir oyuğunda istenen hedefleriyle 50.000 transfekte BW hücresi kullanın. Plakayı 48 saat inkübe edin. Ardından plakayı -20 santigrat derecede dondurun.
Bir ELISA plakasını anti-Mouse IL-2 antikoru ile kaplayın. Her bir oyuğa 50 mikrolitre PBS hacmine% 0.05 mikrogram anti-fare-IL-2 yerleştirin. Kaplanmış plakayı gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.
Daha önce hedefleriyle birlikte inkübe edilmiş donmuş BW hücrelerini çözmek için 37 santigrat derecede kısa bir inkübasyon süresi kullanın. Daha sonra, plakayı santrifüjleyin ve her bir oyuktan 100 mikrolitre süpernatanı önceden kaplanmış ELISA plakasına aktarın ve 2 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Bundan sonra, ELISA plakasına biotin anti-mouse-IL-2 ekleyin. Daha sonra, inkübasyon ve yıkamadan sonra, HRP konjuge Streptavidin plakaya ekleyin. İnkübasyon ve yıkamadan sonra, ELISA plakasının her bir oyuğuna 100 mikrolitre TMB substrat çözeltisi ekleyin. Son olarak, ELISA plakasını 650 nanometrede okuyun.