Reseptör-ligand etkileşimlerini ölçmek için biyomembran kuvvet probu

Bir T hücresi reseptörü, TCR ve antijen sunan bir hücre olan APC üzerinde MHC veya majör histouyumluluk kompleksi tarafından sunulan bir antijenik peptit arasındaki etkileşim, T hücresinin APC üzerinde mekanik bir kuvvet uygulamasına neden olur. Bu fenomen T hücresi aktivasyonu için gereklidir.

Bir biyomembran kuvvet probu (BFP) kullanarak reseptör-ligand etkileşimlerini ölçmek için, slayt tabanlı özel bir hücre odası ile başlayın. Hücre odasını mikroskop altına yerleştirin.

Biyotinile şişmiş RBC'lerin süspansiyonlarını, peptit bağlı MHC-streptavidin-biyotin kompleksleri ile kaplanmış prob cam boncuklarını ve T hücrelerini odaya enjekte edin. Probu, hedefi ve yardımcı tampon dolgulu mikropipetleri haznenin etrafına yerleştirin.

Prob pipeti ile biyotinile edilmiş bir RBC'yi boş bir alana yerleştirin. Hedef mikropipet ile bir T hücresini aspire edin ve onu RBC'nin sağına yerleştirin. Yardımcı mikropipet ile bir prob boncuğu aspire edin ve RBC'nin tepesine takın. Boncuğun streptavidini, RBC'nin biyotinine bağlanır ve bir kuvvet probu oluşturur.

TCR'nin ligandı - MHC'ye bağlı peptit - ve RBC'ye kuvvet uygulamak için T hücresi ile etkileşime girmesine izin vermek için T hücresini kuvvet probu ile hizalayın. RBC'yi deforme eden ve boncuğun yerini alan TCR-peptit bağını kırmak için T hücresini geri çekin.

Bağı kırmak için gereken kuvveti ölçün - daha güçlü bir bağ, daha yüksek bir kuvvete ve kopması için daha fazla zamana ihtiyaç duyar, bu da daha uzun bir kullanım ömrüne işaret eder.

BFP deneyine başlamak için mikroskobu ve ışık kaynağını açın. Odayı ana mikroskop tablasına yerleştirin. Bir sonraki adım, BFP'nin üç mikropipetini de takmaktır. Soldaki prob bir RBC kapmak içindir. Sağdaki hedef hücreyi tutmaktır ve sağ alttaki yardımcı bir boncuk kapmaya yarar.

Takmak için, bir mikropipeti deneysel tamponla doldurmak için bir mikro enjektör kullanın. Mikropipeti pipet tutucusundan çıkarın ve sıvının ucundan damlamasını sağlamak için daha alçak bir yerde tutun. Mikropipeti hızlı bir şekilde tutucu uca yerleştirin ve yerleştirme sırasında mikropipetin içine hava mikro kabarcığı girmediğinden emin olun.

Tutucu vidayı sıkın, ardından her bir pipet tutucuyu ilgili mikro manipülatöre monte edin. Mikropipeti, uçları hazne tampon alanına girecek şekilde hazneye doğru itin. Mikropipetin konumunu ayarlayın ve bunları mikroskop görüş alanı altında bulun.

Üç elementin kolonilerini tek tek bulmak için oda tutucunun sahnesinde dolaşın. Mikropipetin ucunun bir hücreye veya boncuğa yaklaşmasına izin vermek için manipülatörlerin düğmelerini çevirerek ilgili mikropipetin konumunu ayarlayın. İlgili mikropipetin içindeki basıncı ayarlayarak hücreyi veya boncuğu aspire edin. Her üç mikropipet de karşılık gelen elemanlarını yakalayacaktır.

Deneyin gerçekleştirileceği enjekte edilen elementlerin kolonilerinden uzakta açık bir alan bulmak için oda tutucu aşamasının etrafında hareket edin.

Görüntüyü bilgisayar programında görselleştirmek için mikroskop görsel modunu değiştirin. Pipet uçlarındaki üç öğeyi de programın görüş alanına taşıyın. Ardından, prob boncuğunu ve RBC'yi hizalayın ve prob boncuğunu RBC'nin tepesine kadar dikkatlice manevra yapın. Şimdi, boncuğu RBC'ye kısaca bastırın ve yavaşça geri çekin.

Yardımcı mikropipetin basıncını, boncuğu RBC tepesine yapıştırılmış halde kalacak şekilde nazikçe üfleyerek uzaklaştırın. Yardımcı mikropipeti uzaklaştırın ve hedefi hizalayın ve boncuğu araştırın.

Programda, Görüş Alanı penceresinde, prob mikropipetinin, RBC'nin ilgili yarıçaplarını ve RBC ile prob boncuğu arasındaki dairesel temas alanını ölçmek için program araçlarını kullanın. Bu değerler, metin protokolünde listelenen denklem ile RBC'nin yay sabitinin tahmin edilmesine izin verir.

İstenen RBC yay sabitini programa girdikten sonra, RBC apex boyunca yatay bir çizgi çizin ve bu, bitişik pencerede bu çizgi boyunca her pikselin parlaklığını gösteren bir eğri verecektir. Eşik çizgisini, eğrinin derinliğinin yaklaşık yarısı kadar olacak şekilde sürükleyin.

Ardından, istediğiniz deney modunu seçin. Parametreleri istediğiniz gibi ayarlayın. Programın hedef pipeti hareket ettirmesine ve hedefi probla temas edip çıkarmasına izin veren Başlat'a tıklayın.

Veri toplama, prob boncuğunun konumunu gerçek zamanlı olarak kaydeden paralel olarak gerçekleştirilecektir. düğmesine tıklayarak programı durdurun Deneyi Durdur bu sırada elde edilen verilerin kaydedilmesine izin vermek için bir pencere açılacaktır.