Viral Antijene Karşı Serumdaki Antikor İzotiplerini Tespit Etmek için Viral Antijen Mikroarray Testi

Hazırlanmış bir viral antijen mikrodizi lamı ile viral antijen mikrodizi testine başlayın.

Slayt, her biri bir ızgarada düzenlenmiş noktalara basılmış çoklu viral suşların yüzlerce saflaştırılmış antijenini içeren tek bir diziye sahip birden fazla ped içerir. Her nokta, üç boyutlu mikro gözenekli nitroselüloz yüzey üzerinde adsorbe edilmiş tek bir antijen tipi içerir.

Sonraki adımlarda kolay kullanım için sürgüyü bir hazneye sabitleyin. Antikorların yüzeye spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için slaydın kalan yüzeylerine bağlanan proteinleri içeren bir bloke edici tampon ekleyin.

Mikrodizi slaytını seyreltilmiş insan serumu ile inkübe edin. Serumdaki antikor izotipleri, slayttaki antijenlere özgü, antijenlerin epitoplarını tanır ve bunlara bağlanır.

Serumu çıkarın. Slayttaki bağlanmamış antikorları ve proteinleri çıkarmak için bir tamponla yıkayın.

Her biri farklı bir kuantum noktasına sahip kuantum nokta konjuge ikincil antikor karışımları ekleyin. İzotipe özgü ikincil antikorlar, slayt üzerindeki antijenlere bağlı ilgili serum antikor izotipine spesifik olarak bağlanır.

Mikrodizi lamı içindeki antijenlere antikor bağlanmasını ölçmek için bir mikrodizi görüntüleyici kullanın.

Uygun dalga boylarında uyarılma üzerine, ikincil antikorlara bağlı kuantum noktaları temel duruma geri döner ve fotodetektör tarafından algılanan spesifik floresan sinyalleri yayar.

Nokta floresan yoğunluğu, bireysel antijene bağlı serum içindeki serum antikor izotipini ölçer.

Yazdırma yazılımını istenen protokolle programladıktan sonra, yazdırma işlemini başlatın. Tamamlandığında, problanmamış mikrodizi slaytları oda sıcaklığında bir kurutucu kabinde ışık geçirmez bir kutuya yerleştirin.

Mikrodizi üzerindeki antikorlar için serumları araştırmak için, mikrodizi kayar ped tarafı yukarı bakacak şekilde problama odalarına takmak için klipsler kullanın ve odaları çerçevelere yerleştirin.

Kızakları monte ederken dikkatli olun, çünkü kolayca kırılabilirler ve rehidrasyondan sonra herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse, sızıntıları gidermek için kızakları sökün ve yeniden monte edin.

Slaytları oyuk başına 100 mikrolitre filtrelenmiş bloke edici tampon ile yeniden sulandırın ve serumları numune başına 100 mikrolitre bloke edici tamponda 1 ila 100 oranında seyreltin. Daha sonra, rehidre edilmiş mikrodizi slaytlarını ve seyreltilmiş serumları oda sıcaklığında 30 dakika ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde dakikada 100 ila 250 dönüş boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, pedlere dokunmadan her bir haznenin köşesinden blokaj tamponunu dikkatlice aspire etmek için ikincil bir toplama şişesi ile bir vakum hattına bağlı pipet uçları kullanın ve pedlerin kurumasına izin vermeden seyreltilmiş serumları hemen pedlere ekleyin. Ardından, kapalı çerçeveleri nemi korumak için kapatılmış nemli kağıt havlular içeren tepsilere yerleştirin ve çerçeveleri gece boyunca 4 santigrat derecede sallanan bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.

Kuantum-nokta konjuge ikincil antikor etiketlemesi için, az önce gösterildiği gibi serumları dikkatlice aspire edin ve slaytları, bir orbital çalkalayıcı üzerinde her biri 5 dakika boyunca oyuk başına 100 mikrolitre taze T-TBS tamponunda üç yıkama ile durulayın. Slaytlar daha sonra kuantum-nokta konjuge ikincil antikorların bir karışımı ile inkübe edilir ve daha sonra, az önce gösterildiği gibi aynı tekniği kullanarak protokolde tarif edildiği gibi üç kez yıkanır.

Son yıkamadan sonra, slaytları haznelerden dikkatlice çıkarın ve slaytları filtrelenmiş çift damıtılmış suyla nazikçe durulayın ve ardından her bir slaytı 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Daha sonra slaytları santrifüj ile kurutun.

Mikrodizi slaytlarının görüntülerini almak için, önce taşınabilir görüntüleyiciyi açın ve görüntülenecek slaytı, yüzü aşağı bakacak şekilde görüntüleme odasındaki slayt tutucusuna dikkatlice yerleştirin. Görüntüleme yazılımını açın ve "Configure Imager" (Görüntüleyiciyi Yapılandır) sekmesi altında uygun slayt yapılandırmasını seçin.

"Görüntü Kontrolü" sekmesi altında, uygun floresan kanalını seçin ve serumun reaktivitesine bağlı olarak pozlama ve çekim sürelerini ayarlayın. Ardından, görüntü alımını başlatmak için 'Yakala'yı tıklayın. Alımın sonunda, dizi noktalarını tespit etmek için referans işaretleyicilere yönlendirilmiş ızgaraları kullanın.