JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 4:27 dk • July 8th, 2025
Bir tür beyaz kan hücresi olan monositleri, immünomanyetik negatif seçim ile tam kandan izole etmek için, bir tüpte antikoagülan ile tedavi edilmiş insan kanı elde edin. Fc reseptör bloke edici antikorlar ve bispesifik tetramerik antikor kompleksleri içeren bir antikor kokteyl çözeltisi ekleyin.
Her antikor kompleksi, beyaz ve kırmızı kan hücreleri dahil olmak üzere monosit olmayan hücreler üzerindeki hücre yüzeyi antijenlerine özgü bir antikor ve dekstran için spesifik diğer antikor olmak üzere iki monoklonal antikor içerir.
Dekstran kaplı bir manyetik boncuk çözeltisi ekleyin. Kuluçkaya yatmak. Fc reseptörü bloke edici antikor, monositlerin Fc reseptörüne bağlanarak monoklonal antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önler.
Antikor komplekslerindeki monoklonal antikorlar, monosit olmayan hücreler üzerindeki spesifik hücre yüzeyi antijenlerini tanır ve bunlara bağlanır, böylece monositleri etiketlenmemiş bırakır. Dekstran kaplı manyetik boncuklar, antikor komplekslerinin anti-dekstran antikoruna bağlanır ve monosit olmayan hücreleri boncuklara çapraz bağlar.
Tüpü manyetik bir tutucuya yerleştirin. Yüksek gradyanlı bir manyetik alanın etkisi altında, manyetik boncuk çapraz bağlı hücreler tüp duvarlarına bağlanır ve monositleri tüpün merkezinde bırakır.
Monosit içeren çözeltiyi pipetleyin; taze bir tüpe aktarın. Kalan istenmeyen hücreleri çapraz bağlayarak manyetik boncuklar ekleyin. Monosit popülasyonunu zenginleştiren bir manyetik alanın etkisi altına yerleştirin.
Monosit süspansiyonunu yeni bir tüpe aktarın. Süspansiyonu santrifüjleyin. Daha fazla analiz için monositleri bir tamponda yeniden süspanse edin.
Dört adet 10 mililitrelik EDTA'lı vakum tüpünde 40 mililitre taze insan tam kanı topladıktan sonra, tüm kanı bir biyogüvenlik kabinindeki tek bir 50 mililitrelik konik propilen tüpe aktarmak için steril teknik kullanın. Seçilen bir insan monosit izolasyon kitinden üreticinin talimatlarına göre, kitten kan tüpüne 2 mililitre monosit izolasyon kokteyli ekleyin ve kitten manyetik boncukları 30 saniye boyunca girdaplayın.
Kana 2 milimetre boncuk ekleyin ve boncukları kanla dikkatlice karıştırmak için 25 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, kanı dört adet 50 mililitrelik tüp arasında eşit olarak bölün ve her tüpe 1 milimolar EDTA ile takviye edilmiş 30 mililitre steril PBS ekleyin. 25 mililitrelik plastik bir serolojik pipetle tekrar karıştırın ve tüpleri manyetik tutuculara yerleştirin.
10 dakika sonra, 1 mililitreden fazla kırmızı kan hücresi aspire etmemeye dikkat ederek içeriği her tüpün ortasından çıkarmak için bir pipet kullanın ve tüp içeriğini dört yeni 50 mililitrelik tüpten birine dağıtın. Her tüpe 500 mikrolitre daha girdaplı manyetik boncuk ekleyin ve hücre çözeltisini yavaşça karıştırın. İçeriği her tüpün merkezinden dört yeni 50 milimetrelik tüpten birine dikkatlice aktarmadan önce, tüpleri beş dakika boyunca manyetik tutuculara geri yerleştirin.
Tüm hücre süspansiyonları aktarıldığında, tüp içeriğini dört yeni 50 mililitrelik tüpten oluşan üçüncü bir sete dikkatlice aktarmadan önce her yeni 50 mililitrelik tüpü beş dakika boyunca mıknatıs tutuculara yerleştirin. Daha sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve sayım için dört hücre peletini toplam 10 mililitre steril PBS'de yeniden süspanse edin.
Bu makale, immünomanyetik negatif seleksiyon kullanarak insan tam kanından monositlerin izole edilmesi yöntemini tanımlamaktadır. Süreç, monosit popülasyonunu ileri analizler için zenginleştirmek amacıyla antikor kokteyllerinin ve manyetik boncukların kullanımını içermektedir.
Primer insan monositlerinin izolasyonu, inflamatuar ve enfeksiyöz hastalık modellerinde immün hücre fonksiyonunun mekanistik olarak sorgulanmasına olanak tanır. Bu yöntem, bileşiklerin monosit aracılı yolaklar üzerindeki etkilerini değerlendirmek için saflaştırılmış bir hücresel sistem sağlayarak hedef doğrulamasını destekler. Yüksek saflıktaki monosit preparatları, preklinik risk azaltma stratejilerinde öngörü güvenilirliğini artırır.
Yöntem, hedef doğrulamadan analiz geliştirmeye ve preklinik mekanistik çalışmalara kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, yinelemeli tasarım-üretim-test döngülerine olanak tanır.
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
Son güncelleme: 29 Ağustos 2026