JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 3:05 dk • July 8th, 2025
Monositler, enfeksiyona karşı koruma sağlamak için makrofajlara ve antijen sunan dendritik hücrelere farklılaşan bağışıklık hücreleridir.
Monositleri kültürlemek ve farklılaşmalarını in vitro olarak indüklemek için, uygun bir kültür ortamında birincil insan monositlerinin bir süspansiyonunu alarak başlayın. Hücre süspansiyonunu bir kültür plakasının kuyucuklarına ekleyin. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için fizyolojik koşullarda inkübe edin.
Farklılaşmayı indükleyen sitokinler - granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör veya GM-CSF'yi bir kuyucuğa ve makrofaj koloni uyarıcı faktör veya M-CSF'yi diğerine ekleyin. Uygun bir süre kuluçkaya yatırın.
GM-CSF, hücreler üzerindeki heterodimerik reseptörüne bağlanır ve monositlerin farklılaşmasını indükler. GM-CSF bağlanması, hücre içi sinyal yollarının aktivasyonu ile sonuçlanır ve bu da M1 makrofaj benzeri bir fenotipe hazırlanmak için genlerin ekspresyonuna yol açar.
M1 benzeri hücreler - büyük bir sitoplazmik hacme sahip yuvarlak hücreler - proinflamatuardır ve enfeksiyona karşı savunmaya yardımcı olur.
Diğer kuyuda, M-CSF, monositler üzerindeki homodimerik reseptörüne bağlanır ve hücrelerin farklılaşmasını indükler. M-CSF bağlanması, GM-CSF'den farklı hücre içi sinyal yollarının aktivasyonu ile sonuçlanır ve bu da M2 makrofaj benzeri bir fenotipe hazırlanmak için genlerin ekspresyonuna yol açar.
M2 benzeri hücreler - uzun bir şekle sahip - anti-enflamatuardır ve doku yeniden şekillenmesi ve onarım işlevleri sergiler.
Farklılaşmış makrofaj hücreleri, daha sonraki aşağı akış tahlilleri için hazırdır.
Saydıktan sonra, izole edilen monositleri, antibiyotiklerle desteklenmiş 37 santigrat derece serumsuz RPMI 1640 ortamının mililitresi başına 1 çarpı 10 ila altıncı hücrede yeniden süspanse edin ve 1 mililitre yeniden süspansiyon hücresini bir biyogüvenlik kabininde 35 milimetrelik plakalara yerleştirin. Daha sonra, hücrelerin kuyu diplerine yapışmasını sağlamak için plakaları 30 ila 60 dakika hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
M1 benzeri bir fenotipe sahip makrofajlar için astar yapmak için, her plakaya mililitre GM-CSF başına 25 nanogram içeren 100 mikrolitre fetal sığır serumu ekleyin. M2 benzeri bir fenotipe sahip makrofajlar için astar yapmak için, her plakaya mililitre M-CSF başına 50 nanogram içeren 100 mikrolitre fetal sığır ekleyin.