Fare Dorsal Kök Ganglionundan Makrofajların Mekanik Dissosiyasyon Kullanılarak İzolasyonu

Dorsal kök ganglionu veya DRG, omurilik boyunca periferikten merkezi sinir sistemine duyusal bilgi taşıyan bir nöronal hücre gövdeleri kümesidir. Periferik sinir yaralanması DRG'de makrofaj birikimine ve nöropatik ağrı gelişimine neden olur.

Enzim içermeyen bir yöntem kullanarak canlı makrofajları izole etmek için, hücresel stresi sınırlamak için buz gibi soğuk tamponla doldurulmuş bir homojenizatörde taze disseke fare DRG dokusunu alın. Bir havaneli kullanarak, hücreleri serbest bırakmak için dokuyu mekanik olarak homojenize edin.

Hücre kümelerini çıkarmak ve akışta tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için bir hücre süzgecinden süzün. Doku homojenatı, makrofajları ve nöronların yalıtkan kılıfı olan serbest yüzen miyelini içeren nöronları ve nöronal olmayan hücreleri içerir.

Filtrelenmiş homojenatı, yoğunluk gradyanlı bir ortam ve santrifüj içeren bir tüpe ekleyin. Merkezkaç kuvveti altında, daha yüksek kaldırma kuvveti yoğunluğuna sahip canlı hücreler, miyelin askıda kalırken, bir pelet oluşturmak için tüpün dibine yerleşir. Süpernatanı atın.

Hücreleri, makrofaj spesifik hücre yüzeyi reseptörlerine karşı florofor konjuge antikorlar içeren bir tamponda yeniden süspanse edin. İstenilen süre boyunca kuluçkaya yatırın. Antikor, makrofaj hücreleri üzerindeki reseptörüne bağlanır, böylece hücre yüzeyini floresan olarak etiketler. Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın.

Bir akış sitometresi kullanarak hücreleri analiz edin. Antikora özgü bir floresan sinyali, numunede makrofajların varlığını gösterir.

Deneye başlamadan önce, dokuz hacim ortamı bir hacim kalsiyum ve magnezyum içermeyen 10X HBSS ile karıştırarak yoğunluk gradyan ortamının çalışma çözeltisini hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Arka pençe tutamına yanıt verilmemesi nedeniyle farenin tamamen uyuşturulduğunu onaylayın.

Anestezi uygulanmış bir fareyi, bantla sabitlenmiş dört pençe ile sırtüstü pozisyonda kimyasal bir davlumbazın içine yerleştirerek başlayın. Göğüs kafesinin altındaki cildi kaldırmak için forseps kullanın ve ardından cerrahi makasla karaciğeri ve diyaframı ortaya çıkarmak için küçük bir kesi yapın. Aynı makası kullanarak diyaframı ve göğüs kafesini kesin ve ardından atan kalbi ortaya çıkarmak için plevral boşluğu açın.

Ardından, iris makası ile sağ atriyal apendiksiyi hızlı bir şekilde kesin. Kanama fark edildikten sonra, sol ventrikülün arka ucuna 30 gauge bir iğne yerleştirin ve hayvanı perfüze etmek için yavaşça 10 mililitre önceden soğutulmuş 1X PBS enjekte edin.

Dorsal laminektomi yapmak için fareyi yüzüstü pozisyona getirin. Torasik bölgeden sakral bölgeye kadar iki uzunlamasına lateral derin kesi yapmak için 11 numara bir neşter kullanın. Ardından, sırt kas tabakasını açığa çıkaran cildi çıkarın. Daha sonra, Friedman-Pearson Rongeur ile, lumbosakral omurga süreçleri ve bilateral enine süreçler ortaya çıkana kadar bağ dokularını ve kasları soyun.

İlk olarak, dorsal omurgayı dikkatlice açmak için bir Friedman-Pearson Rongeur kullanın. Ardından, omur kemiklerini çıkarmak için bir Friedman-Pearson Rongeur ve Noyes Yaylı Makas arasında geçiş yapın ve sağlam omurilik sinirleri bağlı olarak omuriliği açığa çıkarın. İpsilateral ve kontralateral lomber DRG'yi dikkatlice inceleyin.

Dounce doku homojenizatöründe 1 mililitre buz gibi soğuk kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1X HBSS'ye yerleştirin. Dounce homojenizatördeki DRG dokusunu gevşek bir havaneli ile 20 ila 25 kez homojenize edin. Steril 50 mililitrelik konik bir tüpe steril bir 70 mikrometre naylon hücre süzgeci yerleştirin. Hücre süzgecini ıslatmak için 800 mikrolitre buz gibi soğuk 1X HBSS kullanın.

Homojenizatörden gelen homojenize doku süspansiyonunu ıslak hücre süzgecine toplamak için bir pipet kullanın ve 50 mililitrelik konik tüpe toplayın. Homojenizatörü 800 mikrolitre buz gibi soğuk 1X HBSS ile iki kez durulayın ve verimi artırmak için sıvıyı aynı 50 mililitrelik konik tüpte toplayın.

Steril 5 mililitrelik polistiren FACS tüpüne 1,5 mililitre dengelenmiş buz gibi soğuk izotonik yoğunluk gradyan ortamı ekleyin. Hücre homojenatını 50 mililitrelik konik tüpten bu FACS tüpüne aktarın ve iyice karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.

Üst kısmı kapatmak için fazladan 500 mikrolitre 1X HBSS ekleyin. Hücreleri 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca 800 kez g'de santrifüjleyin. Tüpün altındaki hücre peletini bozmadan, ortamdaki miyelin içeren süpernatanı dikkatlice aspire edin.

Pelete% 5 fetal sığır serumu içeren 100 mikrolitre PBS ekleyin ve DRG hücrelerini yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücrelere alfa-fare CX3CR1-APC antikoru ekleyin ve karanlıkta 4 santigrat derecede 1 saat inkübe edin.

Hücreleri bir kez 5 mililitre PBS ile yıkayın. Hücreleri 360 kez g'de 4 santigrat derecede 8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve ardından hücre peletini FACS analizi için 300 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin.