Bir Fare Peyer Yamasından Lenfositlerin İzolasyonu

Peyer yamaları, PP'ler, ince bağırsak duvarındaki organize lenfoid dokuların agregatları, B lenfositleri, T lenfositleri, dendritik hücreler ve makrofajlar dahil olmak üzere bağışıklık hücreleri içerir.

Lenfositleri fare PP'lerinden izole etmek için ötenazi yapılmış bir fare ile başlayın. Karın duvarını kesin, periton boşluğunu açığa çıkarın. Çekumu bulun. Çek kemiğini ince bağırsaktan ayırmak için ileoçekal bileşkeyi inceleyin.

İnce bağırsağı periton boşluğundan çıkarmak için mezenteri eksize edin ve ince bağırsağı duodenumdan kesin. İnce bağırsağı soğutulmuş ortam içeren çok kuyulu bir plakaya yerleştirin ve kalıntıları gidermek için durulayın.

İnce bağırsağı mezenterik tarafı aşağı bakacak şekilde konumlandırın ve doku hidrasyonunu korumak için orta ile nemlendirin. PP'leri tanımlayın - bağırsak duvarının anti-mezenterik tarafındaki beyaz çok loblu agregalar.

Çevredeki bağırsak dokusu hariç PP'leri dikkatlice çıkarın. Ortam içeren bir tüpe aktarın. Sürekli çalkalama altında inkübe edin. Bu çalkalama adımı, mukusu, hücre kalıntılarını ve herhangi bir dışkı maddesini PP'lerden ayırır, böylece PP lenfositlerinin geri kazanımını iyileştirir.

Daha sonra, dokuyu uygun bir ağ boyutuna sahip bir hücre süzgecine aktarın. PP'leri nazikçe parçalayın ve hücreleri serbest bırakın. Tek hücreli bir lenfosit süspansiyonu elde etmek için süzgeçten orta ile yıkayın. Hücre stabilitesini korumak için süspansiyonu düşük bir sıcaklıkta santrifüjleyin.

Lenfositleri ortamda yeniden süspanse edin ve daha fazla analiz için kullanın.

Bir fareyi sırtüstü pozisyona getirerek ve karnı% 70 etanol ile sterilize ederek başlayın. Periton boşluğunu açmak ve çekum ile ileoçekal bileşkeyi bulmak için pubisten göğüs kafesine kadar deri ve periton boyunca orta hat abdominal bir kesi yapın.

İnce bağırsağı çekumdan ayırmak için kavşakta mümkün olduğunca distal kesim yapın ve tüm ince bağırsağı pilor sfinktere kadar dikkatlice çıkarmak için mezenteri makasla kesin.

İnce bağırsağı karın boşluğundan tamamen ayırmak için pilor ve duodenum arasındaki bağlantıyı kesin ve izole edilmiş ince bağırsağı, buz üzerinde% 10 Fetal Sığır Serumu veya FBS ile desteklenmiş soğuk RPMI ortamı içeren altı oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Ardından, tüm segmentler soğuk ortama batırılana kadar dokuları manuel olarak hafifçe çalkalayın.

Tüm bağırsaklar hasat edildiğinde, bağırsağın bir kenarının mezenterik yağını kavramak için forseps kullanın ve numuneyi - mezenterik tarafı aşağı bakacak şekilde - bir kağıt havlu üzerine yerleştirin. Doku dehidrasyonunu ve yapışkanlığını önlemek için tüm bağırsak segmentini RPMI artı% 10 FBS ile nemlendirin ve bağırsak duvarının anti-mezenterik tarafında karnabahar benzeri bir şekle sahip beyaz çok loblu agregalar olarak görünen Peyer yamalarını bulun.

Peyer'in yamalarını hasat etmek için, her bir yamayı distal ve proksimal sınırlarından nazikçe çıkarmak için eğri yukarı bakacak şekilde kavisli cerrahi makas kullanın, çevredeki bağırsak dokusunu dışlamaya özen gösterin ve Peyer yamalarını, toplandıkları gibi buz üzerinde buz gibi soğuk RPMI artı %10 FBS içeren 12 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin.

Tüm yamalar elde edildiğinde, 1 mililitrelik bir mikropipet ucunun ucunu kesmek için makas kullanın, böylece çap tek tek Peyer yamalarını aspire edecek kadar büyük olur ve Peyer yamalarını fare başına 150 mililitrelik konik tüpe aktarın, 25 mililitre 37 santigrat derece RPMI artı% 10 FBS içerir.

Ardından, tüpleri 10 dakika boyunca 125 ila 150 RPM'de sürekli çalkalama ile 37 santigrat derecede bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin. Çalkalamanın sonunda, Peyer'in yamalarını fare başına 140 mikrometre hücre süzgecine aktarın ve Peyer'in yamalarını ağdan tek tek 50 mililitrelik konik tüplere nazikçe parçalamak için hayvan başına 110 mililitrelik şırınga pistonunun kauçuk ucunu kullanın.

Süzgeçleri 15 ila 20 mililitre soğuk RPMI artı% 10 FBS ile durulayın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Süpernatanı dikkatlice attıktan sonra, hücreleri mililitre RPMI başına yaklaşık 1 x 10⁷ hücre artı sayım için% 10 FBS konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, 200 mikro litre ortam başına 2 ila 2,5 x 10⁶ hücreyi, 96 oyuklu yuvarlak bir alt plakanın her bir oyuğuna aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin.