Ortak Lenfoid Progenitörlerden Plazmasitoid Dendritik Hücrelerin İn Vitro Üretimi

Plazmositoid dendritik hücreler veya pDC'ler, sitokin tip-I interferon üreterek enfeksiyona yanıt veren bağışıklık hücreleridir.

İn vitro pDC'ler oluşturmak için, fare kemik iliğinden izole edilen ortak lenfoid progenitör hücrelerin veya CLP'lerin bir süspansiyonunu alın. CLP'ler lenfositlere ve dendritik hücrelere farklılaşabilir.

Hücre süspansiyonunu, proliferasyonu inhibe etmek için gama ışınları ile ışınlanmış bir besleyici hücre tabakası - yapışık stromal hücreler - üzerine ekleyin. Besleyici hücreler, CLP'lerin farklılaşması için gerekli olan sitokinleri ve hücre-hücre temasını sağlar.

Yeterli konsantrasyonda Fms benzeri tirozin kinaz 3 ligandı veya FL - pDC gelişimini destekleyen iki değerlikli bir sitokin - ekleyin ve inkübe edin.

CLP'ler besleyici hücreler arasında göç eder ve parke taşı alanları olarak adlandırılan hücre grupları oluşturmak için çoğalır.

Ortamdaki FL, CLP'ler üzerindeki Flt3 reseptörüne - bir tirozin kinaz reseptörü - bağlanır. Bağlanma, sitoplazmik alan üzerindeki reseptör dimerizasyonunu ve tirozin kalıntılarının otofosforilasyonunu indükler.

Sitoplazmik adaptör proteinler bu kalıntılara bağlanır ve fosforile hale gelerek sinyali aşağı akış sinyalizasyon bileşenlerine dönüştürür. Sinyal kaskadın, CLP'lerin pDC'lere (süspansiyon halinde büyüyen küçük yuvarlak hücreler) ve ayrıca geleneksel dendritik hücrelere veya cDC'lere - daha büyük iğ şeklindeki yapışık hücrelere farklılaşmasına neden olur.

Hücreleri toplayın. pDC ve cDC'ye özgü yüzey işaretleyicilerine karşı antikorlar ekleyin. Akış sitometrisi kullanarak hücreleri analiz edin.

pDC'ye özgü belirteçler için pozitif ve cDC'ye özgü belirteçler için negatif hücreler başarılı pDC gelişimini gösterir.

Ortak lenfoid progenitörleri veya CLP'leri akış sitometrisi ile analiz etmek için, daha sonra, FC hücreleri bir ila iki dakika boyunca anti-CD16 / 32 ile bloke eder, ardından hücrelerin uygun antikor kokteyli ile aynı anda boyanmasını sağlar.

Buz üzerinde 15 dakika sonra, hücreleri üç mililitre FACS tamponunda yıkayın ve peleti 300 mikrolitre taze FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir süzgeçten süzün ve uygun filtreleri ve voltajları kullanarak hücreleri hemen bir akış sitometresinde sıralayın ve ilgilenilen hücreleri 8 mililitre tam RPMI içeren 15 mililitrelik bir tüpte toplayın.

Yüksek oranda zenginleştirilmiş bir pDC popülasyonu oluşturmak için, AC-6 besleyici sistemli in vitro kültür için hasat edilen kemik iliği hücresinden doğru CLP popülasyonunu ayırmak çok önemlidir.

Sıralamanın sonunda, hücreleri aşağı doğru döndürün ve CLP hücre peletini, mililitre başına yaklaşık 5 kez 10 ila 4. hücreler arasında bir hücre yoğunluğu elde etmek için yeterli tam RPMI ile yeniden süspanse edin. Daha sonra, AC-6 besleyici hücrelerini içeren 12 oyuklu plakaya oyuk başına 500 hücre tohumlayın ve ko-kültürleri mililitre FLT3 ligandı başına 100 nanogram ile destekleyin. Daha sonra, dendritik hücrenin veya DC gelişiminin mikroskop altında periyodik olarak görsel olarak izlenmesi ile hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

12. günde, ko-kültür süpernatantındaki hücreleri hasat edin ve her bir kuyucuğu bir kez yarım mililitre tam RPMI ortamı ile yıkayın, elde edilen süpernatanları ve yıkamaları bir araya getirin. Daha sonra, her bir oyuğa yarım mililitre taze ortam ekleyin ve yapışan hücreleri ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Ayrılan hücreleri yüzen hücrelerle birleştirin ve elde edilen hücre süspansiyonunu santrifüjleyin, peleti 50 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin.

Ardından, hücreleri sayın ve az önce gösterildiği gibi F_c blokajından sonra CD11c, CD11b ve B220 ekspresyonu için boyayın. Ko-kültürlenmiş hücreler daha sonra konvansiyonel CD11c pozitif, CD11b pozitif, B220 negatif ve plazmasitoid CD11c pozitif, CD11b negatif, B220 pozitif DC popülasyonlarının varlığı için analiz edilebilir.