Monositlerden Olgunlaşmamış, Olgun ve Tolerojenik Dendritik Hücrelerin Üretilmesi

Bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak için, dendritik hücreler, DC'ler, MHC sınıf-II ve ko-stimülatör moleküller CD80 ve CD86 ile görüntülenen bir antijen sunar. İmmün yanıt özelliklerine bağlı olarak, olgunlaşmamış, olgun ve tolerojenik DC'lere ayrılırlar.

İn vitro olarak çeşitli dendritik hücre alt kümeleri oluşturmak için, insan monositlerini içeren çok kuyulu bir plaka ile başlayın - büyüme faktörleri ve bir sinyal molekülü olan sitokin IL-4 içeren tam bir ortamda bağışıklık öncü hücreleri.

Hücreleri uzun süre inkübe edin. Büyüme faktörleri ve IL-4, monosit proliferasyonunu ve olgunlaşmamış DC'lere farklılaşmayı indükler.

Olgunlaşmamış DC'ler, örüntü tanıma reseptörlerine, PRR'lere sahiptir ve düşük MHC sınıf-II ve ko-stimülatör molekülleri eksprese eder ve bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak için azalmış bir kapasite sergiler.

İmmünomodülatör ajanlar - D3 vitamini ve glukokortikoidler ile olgunlaşmamış DC'leri içeren bir kuyuyu tedavi edin. Bu immünomodülatör ajanlar, MHC sınıf-II ve ko-stimülatör moleküllerin ekspresyonunu aşağı regüle eder. Bu, abartılı veya istenmeyen bağışıklık tepkilerini önleyen immüno-düzenleyici hücreler olan tolerojenik DC'lere farklılaşmaya yol açar.

Olgunlaşmamış DC'leri içeren başka bir kuyuyu lipopolisakkarit, LPS - bir antijen ile tedavi edin. LPS, hücrelerin toll benzeri reseptörü-4 - bir PRR ile etkileşime girer, bir sinyal kaskadı başlatır ve bunları olgun hücrelere farklılaştırır. Bu hücreler, yüksek MHC sınıf-II, ko-stimülatör moleküller ve PRR'leri eksprese eder - antijen işleme ve sunumu için etkilidir.

Dendritik hücre alt tiplerini temsil eden farklı morfolojik özellikler için diferansiyel olarak muamele edilmiş kuyuları gözlemleyin.

Altı oyuklu plakalarda mililitre IL-4 hücre kültürü ortamı başına 0.3 ila 0.5 x^{10 6} konsantrasyonda dört set CD14 + monosit tohumlayın. Hücreleri% 5 CO₂ ile 37 santigrat derecede bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin. 4. günde, kültürden 850 mikrolitre besiyerini çıkarın ve santrifüjleyin.

Süpernatanı aspire edin ve peleti 1 mililitre hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Hücre karışımını tekrar kültüre ekleyin. 5. günde, tolerojenik moDC'ler oluşturmak için setlerin mililitresi ila iki tanesi başına 1 mikrolitre D3 vitamini stoğu ve 1 mikrolitre deksametazon stoğu ekleyin.

6. günde, tüm setlere mililitre GM-CSF başına 200 nanogram ve mililitre IL-4 başına 200 nanogram ekleyin. Olgun moDC'ler oluşturmak için yalnızca GM-CSF ve IL-4 ile muamele edilen setlerden birine mililitre LPS başına 1 mikrogram ekleyin.

LPS tolerojenik moDC'ler oluşturmak için bir tolerojenik mod moDC'lerine mililitre başına 1 mikrogram LPS ekleyin. Son olarak, 7. günde, kültür kabını PBS-EDTA ile yıkayarak farklı moDC türlerini hasat edin.