JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 3:58 dk. • July 8th, 2025
B hücrelerinin immünomanyetik negatif ayrımını gerçekleştirmek için, kanın pıhtılaşmasını önlemek için insan periferik kanını antikoagülan içeren bir tüpte toplayın. Diğer kan hücrelerini etkilemeden eritrositleri parçalamak için kırmızı kan hücresi, RBC, lizis tamponu ekleyin.
Süpernatantta kalan daha az yoğun parçalanmış RBC'lerden sağlam, daha yoğun kan hücrelerini çökeltmek için santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Peleti taze ortamda tekrar askıya alın.
Hücreleri bir kültür plakasına aktarın. B hücreleri de dahil olmak üzere yapışık olmayan hücreler süspansiyon halinde kalırken makrofajların ve monositlerin plakaya yapışmasına izin vermek için inkübe edin.
Süspansiyon halindeki hücreleri yeni bir tüpe toplayın. Hücreleri peletlemek için santrifüjleyin ve bir tampon içinde yeniden süspanse edin.
B hücreleri dışındaki kan hücrelerine özgü biyotinile antikorlar içeren bir kokteyl çözeltisi ekleyin. Antikorlar, B olmayan hücrelerin yüzeyindeki antijenlere bağlanır ve B hücrelerini etiketlenmemiş halde bırakır.
merkezkaç. Bağlanmamış antikorlar içeren süpernatanı atın.
Streptavidin konjuge manyetik boncuklardan oluşan bir çözelti ekleyin. İnkübasyon sırasında, mikroboncuklar üzerindeki streptavidin, B olmayan hücrelere bağlanan biyotinile antikorlara sıkıca bağlanarak kompleksler oluşturur.
Manyetik boncuklara bağlı B olmayan hücreleri tüp duvarlarına yapıştırmak için tüpü bir manyetik alana yerleştirin ve B hücrelerini askıda bırakın. Saf B hücreleri içeren süpernatanı bir tüpe aktarın.
Daha fazla aşağı akış analizi için B hücrelerini ortamda santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin.
Medyan kübital damardan potasyum takviyeli EDTA içeren 15 mililitrelik bir tüpe 10 mililitrelik bir kan örneği aldıktan hemen sonra, pıhtı oluşumunu önlemek için tüpü birkaç kez ters çevirin. Daha sonra, oda sıcaklığında 5 dakikalık bir inkübasyon için hücrelere 35 mililitre otoklavlanmış kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin.
Tüpten ışık gözlemlendiğinde, kanı santrifüjleyin ve beyaz bir topağın varlığını onaylayın. Artık lizis tamponunu 10 mililitre otoklav ile PBS'ye çıkarın ve peleti 10 mililitre RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin.
Hücreleri, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 30 dakikalık bir inkübasyon için 10 santimetrelik bir kültür kabına koyun. Ardından, kültür kabını birkaç kez hafifçe döndürün ve yüzen hücreleri 15 mililitrelik plastik bir konik tüpe aktarın.
Santrifüjleme ile iki yıkamadan sonra, peleti 200 mikrolitre soğuk PBS tamponunda mililitre konsantrasyonda 5 ila 10 x 106 hücrede yeniden süspanse edin ve 1 x 106 hücre başına kan hücrelerine özgü 5 mikrolitre biyotinile anti-insan antikor kokteyli ekleyin.
Buz üzerinde 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, hücreleri 10 kat fazla steril PBS hacminde yıkayın ve peleti buz üzerinde 30 dakikalık bir inkübasyon için 1 x 106 hücre başına 5 mikrolitre streptavidin konjuge mikro boncuk içinde yeniden süspanse edin. İnkübasyonun sonunda, hücrelere 2 mililitre PBS tamponu ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında 8 dakika boyunca manyetik bir stand üzerine yerleştirin.
Mikro boncuklar tüpün duvarına yapıştığında, süpernatanı dikkatlice yeni bir konik tüpe aktarın ve hücrelere 2 mililitre daha PBS tamponu ekleyin. İkinci süpernatant toplamasından sonra, havuzlanmış hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve hücreleri, mililitre konsantrasyonunda 1 x 107 hücrede taze PBS tamponunda 5 mililitrelik bir polistiren tüpe aktarın.