Antikor Salgılayan B Hücrelerinin ELISpot Testi Kullanılarak Fonksiyonel Değerlendirmesi

Antikor salgılayan B hücreleri veya ASC'ler, patojenlere karşı koruma sağlamak için IgG ve IgM dahil olmak üzere antikor izotiplerini salgılayan farklılaşmış B hücreleridir.

ASC'lerin in vitro fonksiyonel bir değerlendirmesini yapmak için, enzime bağlı immünosorbent nokta testi ile başlayın. Tabanda aktif bir poliviniliden florür zarı içeren bir ELISpot plakası alın.

Kuyucukları, antikorun Fc bölgesi olmadan yalnızca Fab bölgeleri içeren poliklonal antikor fragmanları ile inkübe edin. Her Fab bölgesi, her iki izotipin tanımlanmasını sağlayan spesifik antikor izotipleri - IgG veya IgM için bir bağlanma bölgesine sahiptir.

İnkübasyon sırasında, antikor parçaları zara yapışır ve immobilizasyona yol açar.

Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için kuyuları engelleme solüsyonlarıyla kaplayın. Plakayı aktive edilmiş antikor salgılayan B hücreleri ile tohumlayın ve inkübe edin. ASC'ler, zara bağlı antikor fragmanlarına bağlanan IgG ve IgM dahil olmak üzere farklı izotipler salgılar.

Bağlanmamış salgılanan antikorları çıkarmak için plakayı bir tamponla yıkayın. Bazı kuyucukları IgM için enzim konjuge tespit antikorları ve diğerlerini IgG için tespit antikorları ile tedavi edin ve inkübe edin.

Tespit antikorları, ilgili izotiplerine bağlanarak immünokompleksler oluşturur.

Enzimlerle etkileşime giren ve zar üzerinde mor renkli lekeler oluşturan tüm kuyucuklara kolorimetrik substratlar ekleyin. Reaksiyonu durdurmak için durdurucu bir çözelti ekleyin.

Her bir oyukta üretilen renkli nokta, B hücrelerinin salgı aktivitesi ile ilişkili olarak spesifik antikorun izotipinin varlığını gösterir.

Tüm hücreler hasat edildiğinde, alt kümeleri taze RPMI ortamında mililitre başına 1 ila 10 x 10⁵ hücre konsantrasyonunda 12 oyuklu bir hücre kültürü plakasının ayrı oyuklarına tohumlayın. Daha sonra, B hücrelerini, beş gün boyunca hücre kültürü inkübatöründe kuyu başına mililitre başına 1 x 10⁶ hücre başına 5 mikrogram CpG (ODN 2006) ile aktive edin.

Aktivasyonun sonunda, ELISpot plakalarının her bir kuyucuğuna 30 saniye boyunca damıtılmış su içinde 30 mikrolitre% 35 etanol ekleyin. Daha sonra, her bir oyuktaki etanolü 150 mikrolitre otoklavlanmış çift damıtılmış su ile değiştirin ve kalan etanolü çıkarmak için plakaları oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Bir PBS yıkaması yapın, ardından her bir oyuğa 50 mikrolitre poliklonal F (ab ') 2 anti-insan Ig parçası ekleyin.

Plakaları gösterildiği gibi PBS ile iki kez yıkayın. Oda sıcaklığında iki saat boyunca BSA'lı 200 mikrolitre taze PBS ile her bir oyuktaki spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin. Başka bir PBS yıkama serisinden sonra, kuyucukları 37 santigrat derecede 100 mikrolitre taze RPMI 1640 ortamında inkübe edin. Ardından, her bir ELISpot kuyusundaki ortamı uygun sayıda aktive edilmiş B hücresi ile değiştirin.

Her bir kuyucuğun son hacmini taze RPMI ortamı ile 150 mikrolitreye getirin. Ardından, ELISpot plakasını 8 ila 14 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Kuluçka süresinin sonunda, ortamı atın ve kuyuları 200 mikrolitre PBS artı Tween 20 ile beş adet 3 dakikalık yıkama için yıkayın.

Son yıkamadan sonra, uygun tespit antikorlarını karşılık gelen kuyucuklarına ekleyin ve plakaları karanlıkta iki saat inkübe edin. Başka bir PBS yıkama serisinden sonra, oda sıcaklığında 5 ila 15 dakika boyunca her bir oyuğa 50 mikrolitre BCIP / NBT substratı ekleyin.

Mor lekeler göründüğünde, oyuk başına 100 mikrolitre çift damıtılmış su ile reaksiyonu durdurun ve plakayı akan musluk suyuyla durulayın. Ardından, ışıktan korunan ELISpot membranlarını havayla kurutun.