Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden Doğal Öldürücü Hücrelerin Ex Vivo Genişlemesi

Doğal öldürücü NK hücreleri, tümörleri ve mikrobiyal enfeksiyonları ortadan kaldıran büyük granüler lenfositlerdir.

İçin ex vivo NK hücre genişlemesi, NK hücreleri de dahil olmak üzere heterojen bir lenfosit popülasyonu içeren periferik kan mononükleer hücrelerinin, PBMC'lerin bir süspansiyonunu alın. NK hücrelerini aktive etmek ve genişletmek için gerekli olan zara bağlı interlökin 21, mIL-21'i eksprese eden ışınlanmış besleyici hücreler - çoğalmayan lenfoblastoid hücreler - ekleyin.

Ko-kültürü, altta gaz geçirgen bir zar bulunan ve gaz değişimine izin veren özel bir kültür kuyusuna ekleyin. Hücreler, geçiş gerektirmeden uzun bir süre boyunca yerleşir ve çoğalır.

NK hücre proliferasyonu için interlökin 2, IL-2 ve interlökin 15, IL-15 - sitokinleri ekleyin. Fizyolojik koşullarda yeterli bir süre kuluçkaya yatırın.

Besleyici hücreler üzerindeki mIL-21, NK hücreleri üzerindeki spesifik bir heterodimerik reseptöre bağlanır. Eksojen IL-15 ve IL-2, ilgili reseptörlerine bağlanır. Bağlanma, hücresel yaşlanmayı sınırlayan ve uzun süreli NK hücre çoğalmasına yol açan gen ekspresyonunu aktive eden farklı aşağı akış sinyal yollarını indükler.

Akış sitometrisi kullanarak, NK hücre genişlemesini düzenli zaman aralıklarında değerlendirin.

Hücrelerin genişleme hızını ve saflıklarını analiz etmek için kaydedilen verileri çizin - hedef NK hücre tipinin seçici büyümesi. Kuluçka süresi boyunca manifold genişlemesi, yüksek saflığı korurken sürekli bir proliferasyonu gösterir.

Periferik kan mononükleer hücrelerini veya PBMC'leri ve 100 gama ışınlanmış 221-mIL-21 hücresini, 10 mililitre R-10 ortamı ile 5 dakika boyunca 400 g'da santrifüjleme ile ayrı ayrı yıkayın.

Santrifüjlemeden sonra, akış sitometrisi için 1 x 10⁶ PBMC kaydedin ve 5 x 10⁶ PBMC'yi 10 x 10⁶ 100 gama ışınlanmış 221 mIL-21 hücre ile özel bir 6 oyuklu plakada karıştırın. Aynı 6 oyuklu plakaya insan interlökin-2 ve insan interlökin-15 ile takviye edilmiş 30 mililitre R-10 ortamı ekleyin ve her üç ila dört günde bir ortamı değiştirerek plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin.

Kuluçka sırasında, toplam periferik kan doğal öldürücüsünü veya PBNK hücre sayısını, canlılığını kaydedin ve NK hücre genişleme oranını hesaplamak için her üç ila dört günde bir akış sitometrisi yapın.