Akış Sitometrisi ile İnsan Sitokin ile İndüklenen Öldürücü Hücrelerin CD İşaretleyici Tanıması

Sitokin ile indüklenen öldürücü CIK hücreleri, spesifik sitokinler ve monoklonal antikorlar ile uyarılan periferik kan mononükleer hücre (PBMC) kültürlerinden ex vivo olarak üretilen heterojen immün hücre popülasyonlarıdır. CIK hücreleri, CD3+CD56+ NK-T hücreleri, CD3+CD56-T hücreleri ve CD3-CD56+ NK hücreleri dahil olmak üzere hücre popülasyonlarını içerir.

CIK hücre oranını belirlemek için, PBMC'den türetilmiş bir CIK hücre süspansiyonu içeren tüplerle başlayın. Farklı floroforlara konjuge edilmiş anti-CD3 ve anti-CD56 antikorlarını ve bunların karışımlarını belirlenen tüplere ekleyin. Benzer floroforlara konjuge izotip kontrol antikorlarını diğer tüplere spesifik antikorlar olarak ekleyin.

Floresan işaretli anti-CD3 ve anti-CD56 antikorları, CIK hücre popülasyonlarında eksprese edilen CD3 ve CD56'yı tanır ve bunlara bağlanır. İzotip kontrol antikorları, spesifik olmayan arka plan sinyali ölçümlerini kolaylaştıran hedef antijen özgüllüğünden yoksundur.

Hücreleri, hücre agregalarının çıkarılmasına yardımcı olan hücre süzgeç kapaklı yuvarlak tabanlı tüplere pipetleyin. Tüpleri bir akış sitometresi karuseline yükleyin. Çalışma sırasında her hücre kanaldan geçer ve lazer ışınlarıyla karşılaşarak ışığı saçar.

Bir dedektör, hücre boyutunun göstergesi olan öne doğru saçılan ışık yoğunluğunu ölçer; diğeri, hücre tanecikliğini düşündüren lazer ışınına dik olan yan saçılan ışık yoğunluğunu ölçer. Birlikte, bu bilgiler bağışıklık hücresi popülasyonunu tanımlamaya yardımcı olur.

Eşzamanlı olarak, belirli uyarma dalga boylarına sahip lazer ışınları, hücreler üzerindeki florofor konjuge antikorları uyararak, tespit edilen floresan sinyal emisyonlarına neden olur.

Hücreler üzerindeki spesifik floresan yoğunluklarının analizi, CIK hücre alt popülasyonlarının oranını belirler.

Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi CIK hücrelerinin hazırlanmasıyla başlayın. Ardından, CIK hücrelerini 10 mililitre steril PBS ile yıkayın. 300 kez g ve 18 ila 20 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 5 mililitre PBS ile yeniden süspanse edin. Hücre sayılarını sayın ve tripan mavisi dışlama testini kullanarak hücre canlılığını test edin.

CIK hücrelerini, mililitre PBS başına yaklaşık 0,5 ila 1 milyon hücre yoğunluğunda altı steril 1,5 mililitrelik tüplere ayırın. Hücreleri metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi etiketleyin ve işleyin. 1 mililitrelik steril bir pipetle en az üç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek CIK hücrelerini antikorlarla nazikçe karıştırın. Hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Tüpleri 300 kez g ve 18 ila 20 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 1 mililitre PBS ile yeniden süspanse edin. Ardından, 1 mililitrelik steril bir pipetle hücreleri en az üç kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonunu, kapaktan nazikçe pipetleyerek hücre süzgeci kapaklı steril 5 mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Ardından, tüpleri sırayla atlıkarınca üzerine yerleştirin.

Akış sitometrisi analiz yazılımını açın ve deneysel bir klasör oluşturun. Ardından, deneye bir örnek ve tüp eklemek için "Yeni Örnek" düğmesine tıklayın. Tüpleri metin protokolünde listelendiği gibi adlandırın.

CIK hücre popülasyonları için bir saçılma geçit sistemi oluşturmak için önce tüp 1'i seçin ve bir FSC-A/SSC-A grafiği oluşturmak için Nokta Grafiği düğmesine tıklayın. Hücre kalıntılarını dışlamak için FSC-A eşiği 5.000'den büyük olan tüm hücre popülasyonunun üzerine dikdörtgen bir kapı çizin.

Yeni nokta grafiği için FSC-A/FSC-H parametresini seçin ve tüm tek hücrelerin etrafına bir çokgen kapısı çizin. Yeni histogram grafiği için sayıma karşı FITC-konjuge (CD3) ve sayıma karşı APC-konjuge (CD56) parametresini seçin. Yeni nokta grafiği için FITC konjuge (CD3) ve APC konjuge (CD56) parametresini seçin ve dört alt popülasyonu tanımlamak için dört kadranlı bir kapı çizin.

Her numunedeki 20.000 tek hücreden gelen verileri kaydedin. Önce boş kontrol örneğini analiz etmek için "Örneği Yükle" düğmesine tıklayın. CD56 ve CD3 kanal parametrelerini kullanarak tüm CIK hücre popülasyonunu tanımlayın. CIK hücre popülasyonlarını analiz etmek için tek tek numunenin istatistiksel değerlerini içeren dosyaları açın ve bunları analiz dosyalarına yeniden yazdırın.