Murin Lenfoid Organlarında İnterferon-Gama Sekresyonunun Tanımlanması için Test

Lenfositler T hücreleri ve doğal öldürücü hücreler veya NK hücreleri tarafından salgılanan bir sitokin olan interferon-gama veya IFN-γ, patojenlere karşı bağışıklık tepkisine aracılık eder.

Yerinde IFN-γ üretimini incelemek için, bir model antijen olan ovalbümini tanıyan bir reseptörü eksprese etmek üzere tasarlanmış, floresan etiketli T hücreleri ile nakledilen bir fareyi ele alalım.

Ovalbümini eksprese etmek için genetik olarak modifiye edilmiş bir patojenik bakteri süspansiyonu alın ve fareye intravenöz olarak enjekte ederek sistemik bir enfeksiyona neden olun. Dolaşımdaki bakteriler, bağışıklık hücreleri ile etkileşimi kolaylaştırarak patojenlerin uzaklaştırılmasına yardımcı olan ikincil bir lenfoid organ olan dalağa ulaşır.

Antijen sunan hücreler bakterileri yutar ve antijeni gösterir. T hücreleri, reseptörü aracılığıyla antijene bağlanır, aktive edilir ve IFN-γ üretir.

Bakterilerle enfekte olan makrofaj hücreleri, bağışıklık aracılarını serbest bırakır ve yüzeylerinde aktive edici ligandları yukarı regüle eder. Bu sinyallerle etkileşime girdikten sonra, NK hücreleri aktive olur ve IFN-γ üretir.

IFN-γ sekresyonunu kısıtlamak için hücre içi bir protein taşıma inhibitörü enjekte ederek hücre içi birikimine neden olur.

Fare dalağını hasat edin. Dokuyu sabitleyin ve bölümlere ayırmaya yardımcı olması için dondurun. Bir kriyo-mikrotom kullanarak ince doku kesitleri oluşturun ve bunları cam slaytlara yerleştirin. Yüzey belirteçlerine bağlanan NK hücresine özgü antikorları ve hücre içi IFN-γ'yi boyayan IFN-γ spesifik antikorları ekleyin. Bu antikorlar farklı floroforlarla etiketlenir.

NK hücrelerinin ve T hücrelerinin içindeki IFN-γ'yi tespit etmek için slaydı bir floresan mikroskobu altına yerleştirin.

Fiksatif çözeltiyi atın ve hafif çalkalama altında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5 mililitre PBS ekleyin. Ardından, PBS'yi 5 mililitre% 30 sükroz ile değiştirin ve doku morfolojisini korumak için 12 ila 24 saat inkübe edin. Şimdi, organ plakanın dibinde batıyor.

Numuneyi dondurmak için kuru buzu büyük bir kaba koyun ve içine yaklaşık 50 mililitre saf metanol ve birkaç parça kuru buz içeren daha küçük bir kap yerleştirin. Dalağı tüy bırakmayan bir mendille nazikçe kurulayın. Taban kalıbının altına bir damla OCT bileşiği damlatın ve dalağı kalıbın içine yerleştirin. Herhangi bir baloncuk oluşturmamaya dikkat edin.

Dalağın üzerine yaklaşık 1 mililitre OCT ekleyin. Forseps ile, metanolün OCT'ye temas etmediğinden emin olarak, baz kalıbı kuru buz banyosunda metanolün yüzeyine bırakın. OCT donduğunda kalınlaşacak ve beyaz hale gelecektir. Artefaktları en aza indirmek için dokuyu mümkün olduğunca çabuk dondurmayı unutmayın.

Bir kriyo-mikrotom üzerinde, eksi 21 santigrat derece sıcaklığa ayarlayın. Dokuyu 10 mikrometre civarında istenen kalınlığa kadar kesitlere ayırın. Kesitleri cam mikroskop slaytlarına toplamak için bir fırça kullanın ve görsel olarak inceleyin. Bölümlerin oda sıcaklığına gelmesine izin verin.

OCT'nin dışındaki doku bölümünün etrafına bir sıvı bloker, örneğin bir PAP kalemi ile bir daire çizin. Doku kuruduktan sonra, doku bölümüne 5 dakika boyunca 100 mikrolitre PBS damlatarak numuneyi yeniden sulandırın. Daha sonra, PBS'yi aspirasyon ile bölümden çıkarın ve numune bölümü başına 100 mikrolitre bloke edici çözelti ekleyin. Kapalı bir ıslak odada, oda sıcaklığında en az bir saat inkübe edin.

Birincil antikorlarla lekelemek için, bloke edici çözeltiyi her numune için hazırlanan birincil antikor karışımı ile değiştirin. El yazmasına göre yıkamadan önce oda sıcaklığında dört saat veya kapalı bir ıslak odada gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

Şimdi, ilgilenilen ikincil antikorları, bloke edici çözeltide genellikle mililitre başına 2.5 mikrogram olmak üzere optimum bir konsantrasyona seyreltin. Son yıkama solüsyonunu bölümden çıkarın ve hazırlanan ikincil antikor karışımını bölümün üstüne ekleyin ve kapalı, ıslak bir odada oda sıcaklığında bir ila dört saat inkübe edin.

El yazmasına göre yıkama tamponu ile yıkadıktan sonra, yıkama solüsyonunu çıkarın ve PBS ile son bir yıkama yapın. Fosfat tamponlu salini aspire edin ve kalan PBS'nin bölüm tamamen kurumadan buharlaşmasına izin verin.

Slaytın arkasındaki bölümün çevresine bir daire çizin. Ardından, ortamın tüm bölümü kapladığından emin olarak numunenin üzerine bir damla montaj ortamı yerleştirin ve üstüne dikkatlice bir kapak camı yerleştirin. Numunelerin gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında polimerize olmasına izin verin.

Sabahları, slaytı ters çevrilmiş bir spektral lazer tarama mikroskobunun altına yerleştirin. Sitokinlerin hücre altı lokalizasyonunun analizi için hedefleri 10x/NA 0.40 veya 60x/NA 1.4'e ayarlayın.