Fare Seminifer Tübüllerinden İmmün Düzenleyici Sertoli Hücrelerinin İzolasyonu

Testislerin seminifer tübülleri, germ hücrelerini besleyen Sertoli hücreleri içerir. Sertoli hücreleri sıkı bağlantılarla bağlanır ve hyaluronik asit açısından zengin bazal matrise sıkıca bağlanır. Sertoli hücrelerinin bu düzenlemesi, bağışıklık hücresinin tübüle girişini düzenler ve gelişmekte olan germ hücrelerini bozulmaya karşı korur.

Sertoli hücrelerini izole etmek için, fare testislerinden türetilen kısmen sindirilmiş seminifer tübüller içeren bir tüp ile başlayın. Bu tübüller, seminifer tübülleri çevreleyen düz kas hücreleri olan peritübüler hücrelerden yoksundur.

Tübüllere, hyaluronik asidin hidrolizi için gerekli olan hyaluronidaz ve DNaz içeren bir enzim kokteyli uygulayın.

Hyaluronidazlar tübüllere girer ve bir bazal polisakkarit olan hyaluronik asidi parçalayarak bazal matristen Sertoli hücre ayrılmasını başlatır ve germ hücrelerini çözeltiye bırakır. DNaz, çözeltideki herhangi bir DNA kontaminantını sindirerek hücre toplanmasını önler.

Enzimatik olarak sindirilmiş tübülleri bir tamponla yıkayın, artık enzimleri, hücresel parçaları ve germ hücrelerini çıkarın. Sindirilmiş tübülleri yeniden askıya alın ve süspansiyonu bir iğne şırınga tertibatına yükleyin.

Hidrodinamik kesme oluşturmak ve Sertoli hücrelerinin sıkı bağlantılarını bozmak için çözeltiyi tekrar tekrar geçirin ve bunları kalan germ hücreleriyle birlikte tek hücreler olarak serbest bırakın.

Hücre süspansiyonunu filtreleyin, hücresel kalıntıları temizleyin ve tek hücreli bir süspansiyon elde edin. Hücreleri peletlemek için süzüntüyü santrifüjleyin.

Sertoli hücrelerinin seçici genişlemesi için hücreleri serumsuz bir büyüme ortamında yeniden süspanse edin.

Sertoli hücrelerini izole etmek için, çökelmiş tübülleri 25 mililitre PBS'de iyice yeniden süspanse etmek için 25 mililitrelik yeni bir pipet kullanın. Tübüllerin 12 dakika daha oturmasına izin verdikten sonra, tübülleri aynı şekilde üç kez daha yıkamak için aynı pipeti kullanın. Ardından, tübülleri 100 mililitrelik yeni bir vidalı kapaklı şişeye aktarın ve Hyaluronidase-DNase-I çözeltisini ekleyin. Ayrıca, tübülleri 32 santigrat derecede çalkalanan bir su banyosunda beş dakika boyunca sindirin.

100x büyütmede ışık mikroskobu incelemesi ile süspansiyonun bir kısmını kontrol edin. Kısa tübüller, tübüler agregalar ve serbest bırakılan hücreler görünür olmalıdır. Boru şeklindeki agregaların 10 dakika oturmasına izin verin. Ardından, süpernatanı çıkarmak için 25 mililitrelik yeni bir pipet kullanın ve agregaları 25 ml PBS'de dört kez, her yıkama arasında 10 dakikalık çökeltme ile yıkayın.

Kirletici PTC popülasyonu azalmış olacaktır. Son yıkamadan sonra, hücrelere 20 ml RPMI 1640 ortamı ekleyin ve süspansiyonu 10 kez 20 mililitrelik bir şırıngaya monte edilmiş 18G'lik bir iğneden geçirin. Ardından, tüm agregaların ayrıştığını hızlı bir şekilde onaylayın ve saf tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün

.

Süpernatanı dikkatlice aspire etmek için 25 mililitrelik pipeti kullanarak süzüntüyü aşağı doğru döndürün. Daha sonra, izole edilmiş Sertoli hücrelerini 40 ml serumsuz RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, tripan mavisi dışlama ile canlı hücrelerin sayısını sayın ve hücre konsantrasyonunu mililitre başına 3 x 10⁶ hücre olarak ayarlayın. Son olarak, altı oyuklu bir plakada oyuk başına 1 mililitre hücre besleyin.