İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden CD4⁺ Vδ1⁺ γδ T Hücrelerinin Seçici İzolasyonu

γδ T hücreleri, değişken ve sabit alanlara sahip gama ve delta zincirlerinden oluşan T hücresi reseptörlerini, TCR'leri eksprese eder.

CD4+ Vδ1+ T hücreleri - bir γδ T hücresi alt popülasyonu - değişken Vδ1 zincirini ve CD4 ko-reseptörünü birlikte eksprese eder. Bu hücreler iltihaplı dokulara göç eder ve fonksiyonel olarak olgun CD4 + veya CD8 + αβ T hücrelerine dönüşür - bir bağışıklık tepkisine aracılık eder.

CD4 + Vδ1 + T hücrelerini insan periferik kan mononükleer hücrelerinden izole etmek için, PBMC'ler, hücreleri bir tamponda yeniden süspanse eder. Hücre yüzeyi Fc reseptörlerini bloke etmek ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bir Fc bloke edici reaktif kullanın.

γδ T hücrelerinin Vδ1 antijenlerine bağlanan florofor FITC ile konjuge edilmiş anti-Vδ1 antikorları ekleyin. Vδ1 T hücresine bağlı antikorlar üzerindeki FITC boyasına bağlanan anti-FITC antikoruna bağlı manyetik mikro boncuklarla inkübe edin.

Boncuk bağlı Vδ1 + T hücrelerini çekmek için karışımı manyetik bir kolondan geçirin; Vδ1-T hücreleri bağlanmamış kalır ve daha sonra dışarı atılır. Vδ1+ T hücrelerini ayırmak için tamponu içinden iterek sütunu kuvvetlice yıkayın.

Hücreleri, hücrelerin CD4 ko-reseptörüne bağlanan anti-CD4 antikor kaplı manyetik boncuklarla inkübe edin. Boncuk bağlı CD4 + Vδ1 + T hücrelerini çekmek için tüpü bir mıknatısa yerleştirin; CD4- Vδ1+ T hücreleri bağlanmadan kalır.

CD4 + Vδ1 + T hücrelerini bir ortamda yeniden süspanse edin. Boncukları hücrelerden serbest bırakmak için bir boncuk ayırıcı reaktif ekleyin. Boncukları ayırmak için mıknatıs üzerindeki tüpü değiştirin.

Daha fazla analiz için CD4+ Vδ1+ hücre süpernatantını toplayın.

Vδ1 T hücre izolasyonuna başlamadan önce, donör numunedeki Vδ1CD4 pozitif T hücrelerinin frekansını akış sitometrisi ile değerlendirmek için PBMC'nin 1 x 10⁶ alikotunu kullanın. Ardından, lenfositlerin geri kalanını döndürün ve peleti 1 x 10⁷ hücre başına 60 mikrolitre MACS tamponunda yeniden süspanse edin.

Daha sonra, hücreleri 1 x 10⁷ hücre başına 20 mikrolitre Fc bloke edici reaktif içinde bloke edin, ardından karanlıkta 4 santigrat derecede 12 dakika boyunca 1 x 10⁷ hücre başına 10 mikrolitre FITC konjuge anti-insan Vδ1 antikoru ilave edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri 14 mililitre MACS tamponunda yıkayın.

Peletleri 1 x 10⁷ hücre başına 80 mikrolitre MACS tamponunda yeniden süspanse edin ve karıştırarak 1 x 10⁷ hücre başına 20 mikrolitre anti-FITC mikro boncuk ekleyin. Karanlıkta 4 santigrat derecede 15 dakika sonra, hücreleri 10 mililitre taze MACS tamponunda yıkayın.

Santrifüjleme sırasında, önceden soğutulmuş bir manyetik sütunu 500 mikrolitre MACS tamponu ile dengeleyin. Ardından, hücreleri 500 mikrolitre MACS tamponunda yeniden askıya alın ve bunları sütunun üstüne dikkatlice ekleyin.

Sütunu üç adet 500 mikrolitrelik MACS tampon yıkama ile durulayın. Ardından, sütunu mıknatıstan çıkarın ve Vδ1 pozitif hücreleri 1 mililitre MACS tamponu ile 15 mililitrelik konik bir tüpe hızlı bir şekilde yıkamak için bir piston kullanın.

Hücreleri ikinci bir sütundan geçirdikten sonra, 25 mikrolitre CD4 boncuğunu 30 saniye boyunca girdaplayın. Ardından, boncukları 1 mililitre MACS tamponu içeren 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın ve tüpü bir mıknatıs üzerine yerleştirin.

1 dakika sonra, süpernatanı dikkatlice aspire etmek için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve boncukları 25 mikrolitre MACS tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, izole edilmiş Vδ1 pozitif hücreleri döndürün ve peleti 500 mikrolitre MACS tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri boncuklarla kuvvetlice karıştırın. Ardından, 4 santigrat derecede 20 dakika sonra, sürekli eğilerek, tüpü tekrar mıknatısın üzerine yerleştirin.

Herhangi bir numune hacmini kaybetmemek ve kontamine CD4 negatif hücrelerin varlığını en aza indirmek için, kalan tamponu kapağın içinden şişeye geri pipetlemek önemlidir.

İki dakika sonra, CD4 negatif Vδ1 pozitif hücre içeren süpernatanı yeni bir tüpe aktarmak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Ardından, CD4 pozitif hücreleri mıknatıstan çıkarın ve 500 mikrolitre MACS tamponunda yeniden süspanse edin.

CD4 negatif hücreleri iki kez daha çıkardıktan sonra, az önce gösterildiği gibi, CD4 pozitif hücreleri 100 mikrolitre kültür ortamında ve 10 mikrolitre boncuk ayırma solüsyonunu oda sıcaklığında 45 dakika boyunca sürekli eğme ile inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri 1 dakika boyunca mıknatısa geri koyun ve boncuk içermeyen Vδ1 pozitif CD4 pozitif hücre içeren süpernatanı yeni bir tüpe aktarmak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın.

Kalan boncukları iki kez daha çıkardıktan sonra, az önce gösterildiği gibi, hücreleri aşağı doğru döndürün. Daha sonra, Vδ1-pozitif CD4-pozitif hücreleri sayım için taze, önceden ısıtılmış ortamda yeniden süspanse edin.