JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 3:19 dk • July 8th, 2025
Diş eti veya diş eti dokusu, dişlerin servikal kısmını ve çene kemiğini çevreler.
Dişeti dokusu, alttaki bağ dokusundan kollajen-IV açısından zengin bir bazal membran ile ayrılan bir epitel tabakasından oluşur. Dişeti bağ dokusu, dişetini enfeksiyonlardan koruyan lenfositler, mast hücreleri ve nötrofiller içeren bir bağışıklık hücresi ağı içerir.
Dişeti bağışıklık hücresi ağını izole etmek için, sıkıca tutturulmuş dişeti dokusu içeren murin diş bloklarını alın. Blokları, tip dört kollajenaz ve DNaz içeren bir enzim kokteyli ile tedavi edin.
Kollajenazlar dokuya girerek kollajen-IV'ü bozar ve bazal membranı ve dişeti epitelini bozarak dişetinin dişlerden sarkmasına neden olur. Bu arada, DNazlar DNA kirleticilerini bozar. Tüpe bir kenetleme maddesi ekleyin; iki değerlikli katyonları uzaklaştırmak ve hücre toplanmasını önlemek için.
Sindirilmiş diş bloklarını DNaz besiyeri içeren bir petri kabına aktarın. Diş eti dokusunu diş bloklarından çıkarın ve bir hücre süzgecine aktarın.
Bir piston kullanarak dokuyu ezin. Bu mekanik ayrışma, dişeti bağ tabakasını bozarak bağışıklık hücrelerini dokudan serbest bırakır. Süzgeci ortamla yıkayın ve salınan hücreleri süzüntüde toplayın.
Süzüntüyü santrifüjleyin, hücreleri peletleyin ve artık enzimler ve kalıntılar içeren süpernatanı atın. Bağışıklık hücrelerini taşıyan hücre popülasyonunu, gelecekteki analizler için hazır olacak şekilde tam ortamda yeniden askıya alın.
Dişeti sınırındaki fazla dokuyu ortadan kaldırın ve maksiller ve mandibular blokları buz üzerinde 5 mililitre kollajenaz ve DNaz içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Dokuyu 1 saat boyunca 37 santigrat derecede bir çalkalayıcı inkübatörde sindirin ve son beş dakika boyunca 50 mikrolitre 0.5 molar EDTA ekleyin. Daha sonra, dokulara 5 mililitre soğuk DNaz ortamı ekleyin ve tüp içeriğini döndürerek hafifçe karıştırın. Daha sonra, dört doku bloğunu bir Petri kabına aktarın ve üzerlerini 500 mikrolitre taze DNaz ortamı ile kaplayın.
Diş etini her bir doku bloğundan çıkarmak için bir neşter kullanın ve tabağın tüm içeriğini 50 mililitrelik bir tüpün üzerine 70 mikronluk bir hücre süzgecine aktarın. Petri kabını ve süzgeci 3 ila 5 mililitre taze DNaz besiyeri ile yıkayın ve ardından dişeti dokusunu süzgecin ağına karşı ezmek için steril 3 mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanın. Süzgeci 30 ila 35 mililitre soğuk DNaz ortamı ile durulayın ve süzgeci santrifüjleyin. Daha sonra, peleti bir mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin ve canlı hücrelerin sayısını belirleyin.