$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Makrofaj hücre dışı tuzaklar, MET'ler, patojenleri yakalamak ve ortadan kaldırmak için makrofajlar tarafından salınan ağ benzeri yapılardır.
MET'ler, matris metalloproteinaz-9, MMP-9 ve sitrüline histon H3, H3Cit ile ilişkili hücre dışı kromatin liflerini içerir - argininin sitrüline dönüştürüldüğü modifiye edilmiş bir histon proteini.
Formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü murin akciğer dokusu bölümlerinde MET'leri karakterize etmek için öncelikle slaytları kurutun. Bölümleri deparafinize etmek için ksilene daldırın. Bölümleri yeniden sulandırmak için sulu etanol kullanın.
Formalin ile indüklenen protein çapraz bağlarını kırmak için bölümleri ısıtın ve hedef antijenleri sonraki antikor bağlanması için açığa çıkarın.
Spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için protein içeren bir çözelti ekleyin. Anti-MMP-9, anti-H3Cit ve anti-F4 / 80 birincil antikorlarından oluşan bir kokteyl ile inkübe edin.
Anti-F4/80 antikoru, makrofaj hücre yüzeyi glikoproteini F4/80'e bağlanır. Anti-MMP-9 ve anti-H3Cit antikorları, MET'lerde sırasıyla MMP-9 ve H3Cit'e bağlanır. Hedeflerine bağlı ilgili birincil antikorlarına bağlanan farklı florofor konjuge ikincil antikorlar ekleyin.
Bölümleri DAPI içeren montaj ortamıyla monte edin. DAPI, MET'lerin kromatin liflerini boyar. Konfokal bir mikroskop kullanarak, MET belirteçlerinin floresansını görselleştirmek için bölümleri görüntüleyin.
MET'ler, hücre dışı kromatin lifleri ve F4/80, MMP-9 ve H3Cit'in birlikte ekspresyonu ile karakterize edilir.
FFPE örneklerini antijen alma solüsyonu ile ön işleme tabi tutmak için, slaytları 60 santigrat derecede 60 dakika fırında kurutun. Ardından, numuneleri 5 dakika boyunca oda sıcaklığında% 70 etanole aktarmadan önce slaytları 30 dakika boyunca ksilen çözeltisine aktarın.
Slaytları durulamak için musluk suyu kullandıktan sonra, ısıya dayanıklı plastik sargıya koyun ve 10 dakika boyunca Tris-EDTA pH 9.0'da bir düdüklü tencereye koyarak daha yüksek antijen alımına tabi tutun. Numuneleri 20 dakika soğutun ve musluk suyuna aktarın. Ardından, 5 dakika boyunca bir külbütöre yerleştirin. Musluk suyuyla yıkamayı tekrarlayın ve ardından slaytları külbütör üzerindeki PBS'de bir kez yıkayın.
Numuneleri bloke etmek için,% 5 BSA / PBS'de% 10 tavuk serumu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, makrofaj hücre dışı tuzakları veya makrofajlardaki MET'leri tanımlamak için,% 1 BSA / PBS'de 1 ila 100 primer antikor seyreltmesi ekleyin ve slaytları 16 saat boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.
Numuneleri her biri 5 dakika boyunca bir külbütör üzerinde iki kez yıkamak için PBS kullanın. Karşılık gelen floresan ikincil antikorları %1 BSA/PBS'ye ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin. PBS yıkamalarından sonra, kromatini lekelemek ve numuneleri monte etmek için DAPI içeren montaj ortamı kullanın.
Ters çevrilmiş bir mikroskoba bağlı konfokal bir lazer tarama kafası kullanarak, 20X 0.1 NA hava ve 40X 1.0 NA yağ hedefleri kullanarak floresan görüntüler yakalayın. Satır sıralı, tesviye düğmesine tıklayarak tek düzlemli 512 x 512 piksel görüntüler yakalayın. Analiz için bölüm başına en az 10 görüş alanı ve her sonuç için veri elde edin.