Gama Delta İntraepitelyal Lenfositlerin İntravital Görüntülenmesi

Gama delta intraepitelyal lenfositler, γδ IEL'ler, gama delta T hücre reseptörlerini eksprese eden özelleşmiş göçmen T hücreleridir. Bu hücreler ağırlıklı olarak bağırsak epitelinde bulunur ve bağırsak boyunca patojen translokasyonunu sınırlamak için epitel devriyesi yapar.

Canlı bir organizma içinde γδ IEL'leri görselleştirmek için, kısmen açıkta kalmış bir ince bağırsağa sahip anestezi uygulanmış bir transgenik fare ile başlayın. Transgenik fare, raportör proteinleri - gelişmiş yeşil floresan proteinleri - yalnızca γδ IEL'lerde ifade etmek için genetik olarak modifiye edilmiştir ve bunların izlenmesini sağlar.

Bir elektrokoter kullanarak, antimesenterik yüzey boyunca açıkta kalan ince bağırsak üzerinde bir perforasyon hattı oluşturun ve aşırı kanamayı önleyin.

Bağırsak mukozasını ortaya çıkarmak için perforasyon hattı üzerinde uzunlamasına bir kesi yapın ve birden fazla parmak benzeri çıkıntı gösterin - villus. Her villus, bağırsak lümenine çıkıntı yapan γδ IEL'leri bulunan epitel hücreleri içerir.

Fareyi, açıkta kalan mukozal yüzey doğrudan floresan boya ile temas edecek ve lümene kırmızı floresan verecek şekilde konumlandırın.

Fareyi konfokal bir mikroskop altında görüntüleyin. Villus ucu epitelinden başlayarak z ekseni boyunca farklı odak düzlemlerinde bir villus ve görüntü bulun. Bir 3D görüntü oluşturmak için bu optik bölümleri birleştirin.

İntravital görüntüleme, yeşil floresan γδ IEL'lerin epitel hücresinin kırmızı lümen yakınındaki bazal membranı boyunca dinamik hareketini gösterir.

Kan damarları arasındaki alttaki mezenterin her iki tarafına iki çift forseps yerleştirerek, zarda bir delik oluşturmak için forsepsin uçlarını hafifçe birbirine sürtün. Açılı forseps ve 5 santimetrelik bir dikişe bağlı kavisli, konik uçlu bir iğne kullanarak, peritonun bir tarafına zardaki delikten ve periton astarının diğer tarafından yukarı doğru nüfuz edin, bir sütürü insizyonun üstüne ve altına yakın bir yere yerleştirin ve insizyonu kapatmak için bağırsak halkasını dışsallaştırır.

Başarı olasılığını artırmak için, karın yapısını yerleştirirken herhangi bir kan damarını bağlamayın veya yırtmayın ve bağırsağın herhangi bir yabancı kullanımını sınırlayın.

Daha sonra, bağırsak halkasının altındaki cildi de aynı şekilde kapatın ve alttaki peritondaki önceki dikişlerin arasına insizyonun ortasına bir dikiş yerleştirin. Bir elektrokoter kullanarak, anti-mezenterik sınır boyunca bir perforasyon hattı oluşturun ve ek ısıya bağlı doku hasarını önlemek için hemen bağırsağın yüzeyine birkaç damla su uygulayın.

Kalan suyu çıkarmak için bir Kimwipe ile kurulayın. Koterize dokunun distal kenarında, koterize çizginin uzunluğu boyunca, eksternalize doku segmentinin proksimal ucuna doğru yaklaşık 1,5 santimetrelik yatay bir yarık kesmek için Vannas makası kullanın. Mukozal yüzey açığa çıktığında, dokuyu nemli tutmak için karnı nemli bir Kimwipe ile örtün.

Dönen disk konfokal mikroskopi görüntüleme için, fareyi kapalı bir kapta mikroskoba taşıyın. Görüntüleme yazılımını başlatın ve mikroskobun başını geriye doğru eğin ve Hank'in tamponlu tuzlu su çözeltisindeki 150 mikrolitre 1 mikromolar filo AlexaFluor boyasını cam kapaklı tabana ekleyin. Fareyi, açılan mukozal yüzey doğrudan lamel ile temas edecek şekilde konumlandırın.

Fareyi ve çanağı önceden ısıtılmış bir inkübatörde görüntüleme sahnesine yerleştirin. Her lazer için uyarma yoğunluğunu ve pozlama süresini sırasıyla 10 ila 15 miliwatt ve 120 ila 150 milisaniyeden fazla olmayacak şekilde ayarlayın ve çerçeve ortalamasını "2" olarak ayarlayın.

Arka plan gürültüsünü azaltmak için elektron çarpma kazancı işlevini açın ve piksel boyutunun doğru bir şekilde ölçülmesini sağlamak için 63X objektif kalibrasyonunu seçin. 405 nanometre lazeri ve 20x hava objektifini kullanarak, solunum, peristalsis veya kalp atışı nedeniyle yapay hareket alanlarından kaçınarak, gözle görülür bir hareket veya kayma olmayan bir villus alanını bulmak için çekirdekleri manuel olarak görselleştirin.

XY taramasını kullanarak, ilgilenilen alanın xy koordinatını kaydedin ve gliserol daldırma 63X hedefine geçin. Seçilen alandaki villusların stabil olduğunu doğrulamak için 405 nanometre kanalda 1 dakikaya kadar canlı bir görüntü elde edin ve villöz ucun hemen altındaki ortogonal düzlemi bulmak için odağı ayarlayın.

Daha sonra, villöz uç epitelinin hemen altından, yaklaşık 15 ila 20 mikrometreden başlayarak, 1.5 mikrometrelik adımlarla çekirdeği çözmek zor olana kadar villusa kadar Z-yığınları elde edin. Edinime başladıktan 3 ila 5 dakika sonra, görüntü stabilitesini ve gama-delta intraepitel hücre motilitesini onaylayın ve her villus alanı için 30 ila 60 dakika boyunca görüntü almaya devam edin.