Murin T Yardımcı Lenfositlerinin Radyoaktif İşaretli Monoklonal Antikorlar Kullanılarak Etiketlenmesi

Murin T yardımcısını, tavuk ovalbümin peptidine özgü bir T hücresi reseptörü olan TCR'yi taşıyan Th lenfositlerini radyo-etiketlemek için, istenen radyoaktif aktiviteye sahip radyoaktif işaretli monoklonal antikorlar, mAbs içeren bir tüp alır.

mAb, murin Th lenfosit zarında eksprese edilen TCR'ye özgü bir murin mAb içerir. Bir şelatör, mAb ve pozitron yayan bir bakır izotopunu konjugasyon yaparak kararlı bir kompleks oluşturur.

Radyoaktif işaretli mAb'leri tuzlu su ile seyreltin. Daha sonra, seyreltilmiş radyoaktif işaretli mAb'leri bir Th lenfosit süspansiyonu içeren çok kuyulu bir plakaya ekleyin. Kısaca kuluçkaya yatırın.

Kültür içinde, radyoaktif işaretli mAb'ler, Th lenfosit zarları üzerindeki TCR'lere bağlanır. İnkübasyon sonrası, hücre süspansiyonunu yeni bir tüpe aktarın.

merkezkaç. Bağlanmamış radyoaktif işaretli antikorlar içeren süpernatanı atın. Th lenfositlerini ortamda yeniden süspanse edin ve çok kuyulu bir plakaya aktarın. Uzun süre kuluçkaya yatırın.

Radyoaktif işaretli mAb-TCR bağlanması, klatrin triskeliyonlarının bağlandığı ve klatrin kaplı bir çukur oluşturduğu plazma zarının sitoplazmik tarafına adaptör protein alımına neden olur.

Aksesuar proteinler, vezikülün plazma zarından sıkıştırılmasına yardımcı olur ve radyoaktif işaretli mAb-TCR kompleksinin sitoplazmaya içselleştirilmesini kolaylaştırır. Sonunda, TCR'ler Th lenfosit membranlarında yeniden eksprese edilir.

Radyoaktif işaretli Th lenfositleri daha ileri deneyler için hazırdır.

Tavuk ovalbüminine özgü TH1 hücresi radyoetiketlemesi için, önce ilgilenilen T hücresine özgü radyoaktif antikorun 37 megabekerelini ölü hacim olmayan bir şırıngaya çekmek için bir doz kalibratörü kullanın.

Daha sonra, antikoru bir reaksiyon kabına dağıtın ve şırıngada kalan reaktivite miktarını çekilen miktardan ölçün ve çıkarın. Ardından, mililitre başına 37 megabekerel çözeltisi oluşturmak için bardağa bir mililitre salin ekleyin.

Daha sonra, 48 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 0.5 ml tam ortamda altıncı OVA-TH1 hücrelerine iki kez 10 ekleyin, ardından 20 mikrolitre radyoaktif işaretli antikor çözeltisi ekleyin. Radyasyona karşı güvenli 37 santigrat derece ve% 7.5 karbondioksit hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika sonra, radyoaktif işaretli hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpte 10 mililitre 37 santigrat derece PBS'de iki yıkama için birleştirin.