GM-CSF Üreten T Yardımcı Hücrelerini Naif T Hücrelerinden Ayırt Etmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör, GM-CSF, GM-CSF üreten T yardımcısı veya T_HGM hücreleri tarafından salgılanır. Bu hücreler, diğer T yardımcı hücresine özgü sitokinlerin düşük bir ekspresyonunu gösterir.

T_HGM hücrelerinin in vitro farklılaşmasına başlamak için, antijenle aktive olmuş olgun hücreler ve farklılaşmamış saf hücreler içeren fare dalağından izole edilmiş bir T yardımcı hücre süspansiyonu alın.

Naif ve olgun hücrelerin karakteristik yüzey belirteçlerini hedefleyen floresan etiketli antikorlar ekleyin. Naif T hücrelerini izole etmek için floresanla aktive edilen hücre sıralaması yapın.

Hücreleri, T hücresi reseptör kompleksine bağlanan antikorlarla kaplanmış bir kuyuda kaplayın. Ko-stimülatör reseptöre bağlanan bir antikor ekleyin. Sinerjik bağlanma hücreleri aktive eder.

Bir sitokin olan interlökin 7'yi ekleyin, bu da TH_,GM hücrelerine ve GM-CSF üretimine farklılaşmayı indükler. Phorbol miristat asetat, PMA - bir pro-inflamatuar bileşik, iyonomisin - bir kalsiyum iyonofos ve bir protein taşıma inhibitörü ekleyin.

PMA hücreye girer ve bir protein kinazı aktive eder. Zar geçirgen iyonomisin, hücre içindeki kalsiyum iyonlarını yer değiştirir ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu yükseltir.

Protein kinaz aktivasyonu ve yüksek kalsiyum seviyesi, TH_{, GM}hücrelerini yeniden uyaran sinyalleri başlatır ve bu da daha yüksek GM-CSF üretimi ile sonuçlanır. Protein taşıma inhibitörü, GM-CSF sekresyonunu bloke ederek hücre içi algılamaya yardımcı olur.

İmmünofloresan boyama yapın, hücre içi sitokinleri tespit edin ve akış sitometrisi kullanarak hücreleri analiz edin. Hücrelerin çoğunluğu yüksek GM-CSF seviyeleri gösterirken, diğer sitokinlerin düşük ekspresyonu, T_HGM hücrelerine başarılı bir farklılaşmayı gösterir.

CD4 pozitif T hücrelerini izole etmek için, beyaz kan hücresi peletini 5 mililitre hücre izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve herhangi bir kalıntıyı gidermek için hücre süspansiyonunu 30 mikrometrelik bir süzgeçten yeni bir 15 mililitrelik tüpe süzün. Saydıktan sonra, hücreleri 90 mikrolitre tampon konsantrasyonu başına 1 x 10⁷ hücrede yeniden süspanse edin ve her 5 dakikada bir karıştırarak 4 santigrat derecede 15 dakikalık bir inkübasyon için 1 x 10⁷ hücre başına 10 mikrolitre anti-CD4 konjuge manyetik boncuk ekleyin.

Hücreler inkübe edilirken, manyetik bir stand üzerine bir ayırma sütunu yerleştirin ve sütunu 2 mililitre tamponla önceden ıslatın. Daha sonra, hücreleri 5 mililitre tampon ile yıkayın ve peleti 1 mililitre tampon içinde tekrar süspanse edin. Numuneyi kolona yükleyin ve CD4 negatif fraksiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın.

Tüm hücreler kolondan geçtiğinde, rezervuarı kurumadan önce yıkama başına 1 mililitre tampon ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, kolonu 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın ve pozitif boncuk fraksiyonunu dışarı atmak için kolonu 2 mililitre hücre izolasyon tamponu ile daldırın. Daha sonra, CD4 pozitif hücreleri santrifüjleme ile toplayın.

Naif T hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sıralaması için, boncuk sıralanmış CD4 pozitif hücre peletini 500 mikrolitre tamponda yeniden süspanse edin ve hücreleri uygun bir floresan konjuge antikor kokteyli ile karıştırın. Buz üzerinde 20 ila 30 dakika sonra, ışıktan korunarak, hücreleri 5 mililitre taze tamponda yıkayın ve peleti 500 mikrolitre taze tamponda tekrar süspanse edin.

Hücreleri naylon bir ağdan süzün ve hücreleri 500 mikrolitre tampon ile önceden kodlanmış bir FACS tüpüne aktarın. CD4 pozitif, CD25 negatif ve CD44 düşük CD62 ligand yüksek hücre popülasyonlarını seçmek için kapı. Daha sonra, saf CD4 pozitif, CD25 negatif, CD-44 düşük, CD-62 ligand yüksek T hücresi fraksiyonlarını yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne sıralayın ve izole edilmiş saf CD4 pozitif T hücrelerini santrifüjleme ile peletleyin.

Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör veya GM-CSF, T yardımcı hücre farklılaşması için, sıralanmış T hücrelerini 50 mikromolar beta-merkaptoetanol içeren tam RPMI ortamında mililitre başına 1 x^{10 6} hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin ve anti-CD3 epsilon antikorunu önceden kodlanmış 48 oyuklu bir plakanın her bir oyuğundan aspire edin.

Daha sonra, IL-7, anti-CD28 ve anti-IFN gama ile birlikte her bir oyuğa 2,5 x 10⁵ hücre tohumlayın ve hücreleri üç gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO_2'de inkübe edin. Kültürün üçüncü gününde, hücre farklılaşmasını kontrol etmek için bir mikroskop kullanın ve hücreleri santrifüjleme için hasat edin.

Peletleri iki yıkama için taze tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin, sayım için ikinci yıkamadan sonra hücreleri 1 mililitre taze tam ortamda yeniden süspanse edin. Hücreleri üç eşit hacme bölün ve 4 ila 6 saat boyunca bir protein taşıma inhibitörü varlığında PMA ve iyonomisin ile hücrelerin ilk alikotunu yeniden uyarın.

Stimülasyonun sonunda, anti-CD4 antikoru ile boyama için hücreleri toplayın. 30 dakika sonra, hücreleri 20 ila 60 dakika boyunca 200 mikrolitre fiksasyon tamponu ile sabitleyin, ardından yıkama başına 1 mililitre geçirgenlik tamponunda iki yıkama yapın. Ardından, karanlıkta 30 dakika boyunca hücre içi sitokin ekspresyonu için boyayın.