JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 4:12 dk • July 8th, 2025
Antimikrobiyallerin bakteri agregatları üzerindeki etkisini incelemek için, Pseudomonas aeruginosa kültürünü, agrega oluşumunu destekleyen bir büyüme ortamında alın - enfeksiyon sırasında büyümeyi simüle edin.
Tasarlanmış bakteriler, bir floresan mikroskobu altında agrega tespiti için bir floresan proteini eksprese eder. Agregaların hacmini veya bakteriyel biyokütleyi hesaplamak için üç boyutlu olarak görüntüleyin ve zaman içinde biyokütledeki artışı görselleştirin, bu da bakteri üremesini gösterir.
Antibiyotiğe toleranslı olanları seçerken duyarlı bakterileri öldüren öldürücü bir konsantrasyonda katyonik bir antimikrobiyal peptit olan kolistin ekleyin.
Kolistin, bakteri dış zarındaki negatif yüklü lipopolisakkaritlere veya LPS'ye bağlanarak, LPS tek tabakasını stabilize eden katyonik köprülerin yerini alır - zar bütünlüğüne zarar verir.
Kolistin periplazmaya girer ve hücre zarındaki LPS'ye bağlanarak zarı bozar ve hücre lizizine neden olur. Bir karşı mekanizma olarak, bir bakteri alt kümesindeki spesifik genetik mutasyonlar, LPS'nin negatif yükünü nötralize eder. Bu modifikasyon, katyonik kolistinin daha az anyonik LPS ile elektrostatik etkileşimini inhibe ederek hücre ölümünü önler.
Zamanla azalan biyokütleyi görselleştirmek için görüntü, antimikrobiyalin etkisini gösterir. DNA'yı bağlamak için hasarlı zardan giren ve yalnızca ölü hücreleri etiketleyen propidyum iyodür veya PI - bir floresan boya - ekleyin.
PI etiketli duyarlı hücreleri ve floresan etiketli antibiyotiğe toleranslı hücreleri ayıran floresanla aktive edilen hücre sıralama veya FACS gerçekleştirin. Hücreler aşağı akış tahlilleri için hazırdır.
Pseudomonas aeruginosa agregatlarını konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntülemek için, inkübasyonun sonunda, antibiyotik tedavisi bir kuyuda ve "tedavi kontrolü yok" da tekrarlanırken kültür plakasının üç kuyusunu belirleyin ve plakayı mikroskobun ısıtılmış aşamasına yerleştirin.
63 kez yağa daldırma hedefi seçin ve parlak alandaki bakteri agregalarını tanımlamak için Bul sekmesini açın. Her kuyucuk içinde görüntüleme için bir alan tanımlayın ve alan konumunu kaydetmek için Pozisyonlar modülünü kullanın. Uyarma dalga boyunu 488 nanometreye ve emisyon dalga boyunu 509 nanometreye ayarlayın.
Alma modülünde, görüntüleri almak için Z-Stack seçeneğini belirleyin ve Z-yığını görüntülerinin toplam hacmi içinde GFP kanalındaki arka plan floresansını azaltmak için Çizgi Ortalaması modülünü kullanın. Zaman Serisi seçeneğini, 18 saat boyunca 15 dakikalık aralıklarla her bir kutucukta 60 dilim yakalayacak şekilde ayarlayın ve deney boyunca her zaman noktasında yeniden görüntülenecek her konum için bir odak düzlemi depolamak üzere kesin odak stratejisini kullanın.
Görüntüleme deneyini kurduktan 4,5 saat sonra, antibiyotik ilavesinden önce dört kuyucuğun her birindeki toplam biyokütleyi belirlemek için her bir konumu görüntüleyin. Altı saat sonra, her bir oyuğun ortasına, hava-sıvı arayüzünün hemen altına, minimum inhibitör konsantrasyonun iki kez altında nazikçe antibiyotik ekleyin ve antibiyotik tedavisi sonrası görüntülemeye başlamak için Deneyi Başlat'a tıklayın.
Canlı hücreleri izole etmek için, 18 saatlik görüntüleme süresinin sonunda, üreticinin tavsiyelerine göre her bir oyuktaki bakterileri uygun hacimde propidyum iyodür ile etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, plakayı akış sitometresine aktarmak için yalıtılmış bir kap kullanın ve sitometreyi 70 mikronluk bir nozul kullanarak GFP ve propidyum iyodürü tespit edecek şekilde ayarlayın. Ardından, canlı GFP pozitif ve cansız propidium iyodür negatif Pseudomonas aeruginosa agregalarını sıralamak için her kültür süpernatanının 1 mililitrelik alikotlarını en düşük akış hızında çalıştırın.