Floresan Görüntüleme Kullanılarak Konak Hücrelere Bakteri Yapışmasının Tespiti

Bakteriyel yapışmaya duyarlı yapışkan epitel hücre tek tabakası içeren çok kuyulu bir plaka alın.

İstenen bakteri-epitel hücre oranını elde etmek için patojenik bir bakteri olan floresan proteini etiketli Pseudomonas aeruginosa ekleyin.

Bakterileri epitel hücrelerine yaklaştırmak için santrifüjleyin ve etkileşimleri kolaylaştırın.

Bakteriler üzerindeki proteinli lifler olan tip IV pili, epitel hücreleri üzerindeki spesifik glikolipidlere bağlanarak ve konakçı hücrelere bakteri yapışmasına aracılık ederek çok önemli bir rol oynar.

İnkübasyon sonrası, yapışmayan bakterileri uzaklaştırmak için bir tampon ile yıkayın. Hücre yapısını korumak için hücreleri sabitleyin.

Çekirdeği boyayan, AT açısından zengin DNA bölgelerine güçlü bir şekilde bağlanan floresan bir leke olan DAPI'yi ekleyin. Hücre kurumasını önlemek için hücreleri tamponla örtün.

DAPI ile boyanmış çekirdeğe sahip epitel hücrelerine bağlı GFP etiketli bakterilerin görüntülerini elde edin. Tek bir epitel hücresi üzerindeki yapışık bakterileri numaralandırın.

Doza bağımlı bir şekilde konak hücre başına artan yapışık bakteri, konak-patojen etkileşimlerinin niceliklendirilmesini sağlar.

Bakteriyel yapışma testi için, önceden kültürlenmiş A549 hücre tek katmanlarını, her bir oyuğa 100 mikrolitre ılık PBS ekleyerek üç kez yıkayın ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, PBS'yi atın. Alternatif olarak, PBS'yi ekledikten sonra on saniye bekleyin ve ardından PBS'yi vakum kullanarak çıkarın.

Bakteri birleşmesinin kinetiğini belirlemek için, hücreleri farklı enfeksiyon çeşitliliği ile 100 mikrolitre istenen konsantrasyonda bakteri süspansiyonu ile kaplayın. Bakterileri döndürün ve enfekte olmuş A549 hücrelerini 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir saat daha inkübe edin. Tek katmanları gösterildiği gibi ılık PBS ile beş kez yıkayarak bağlanmamış bakterileri çıkarın.

Daha sonra, buz üzerindeki 96 oyuklu bir plakanın tüm kuyucuklarına 100 mikrolitre% 4 formaldehit ekleyerek hücreleri sabitleyin. 15 dakika sonra, fiksasyon solüsyonunu çıkarmak için plakayı PBS ile üç kez yıkayın, çekirdekleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca mililitre DAPI lekesi başına 50 nanogram ile boyayın.

Hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, enfekte olmuş A549 hücrelerini kurumasını önlemek için 100 mikrolitre PBS ile örtün ve ardından plakayı karanlıkta iki güne kadar 4 santigrat derecede saklayın veya görüntülemeye devam edin.