Bir Antibiyotiğin Minimum İnhibitör Konsantrasyonunu Değerlendirmek için Bir Mikrotitre Plaka Yöntemi

Seri olarak seyreltilmiş bir aminoglikozit antibiyotik içeren mikrotitre plakalarını alın. Plakalardan biri sentetik bir ilaç olan NTBC içerir.

Gram negatif bir bakteri olan Pseudomonas aeruginosa'yı tanıtın ve inkübe edin.

Bakteriler, NTBC ile tedavi edilmeyen kuyucuklarda koruyucu bir hücre dışı pigment olan piyomelanin üretirken, ilaç pyomelanin üretimini önler.

Katyonik antibiyotik, bakteri dış zarındaki anyonik lipopolisakkaritlere veya LPS'ye bağlanarak katyonik köprülerin yerini alır ve zarı dengesizleştirir.

Bakterilere girdikten sonra, antibiyotik 30S ribozomal alt birimindeki aminoasil bölgesine veya A bölgesine bağlanır.

Bağlı antibiyotik, mRNA boyunca aminoasil-tRNA bağlanmasını ve ribozomal hareketi önleyerek protein sentezine müdahale eder ve bakteri üremesini engeller.

İnkübasyon sonrası, bakteri üremesini değerlendirmek için kültürün optik yoğunluğunu ölçün.

Bakteri üremesini önleyen en düşük antibiyotik konsantrasyonu, minimum inhibitör konsantrasyon veya MIC'dir.

NTBC ile muamele edilmiş ve NTBC ile muamele edilmemiş kuyucuklar için benzer MIC değerleri, NTBC'nin bakterilerin antibiyotik duyarlılığı üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermektedir.

MIC testinden bir gün önce, 2- [2-nitro-4-triflorometil) benzoil]-1-3 sikloheksandion veya NTBC ile ve bunlar olmadan LB'de test edilecek suşların kültürlerini hazırlayın. Bu gösteri, NTBC'nin 300 mikromolar dişinin temsili seviyesini kullanır. Uygun NTBC konsantrasyonunu belirlemek için titrasyon yöntemi protokol metninde açıklanmıştır. Kültürleri gece boyunca 37 santigrat derecede havalandırma ile inkübe edin. Ertesi gün, MIC testi için LB artı NTBC ve LB artı DMSO ana çözeltileri yapın.

Bir suş için bir antibiyotiği test etmek için, 2 mililitre LB'ye 600 mikromolar NTBC ekleyin ve NTBC ana çözeltisini yapmak için karıştırın. NTBC, 600 mikromolarlık bir konsantrasyonda eklenir, çünkü aşı eklendiğinde iki kat seyreltilir ve 300 mikromolarlık bir nihai konsantrasyon elde edilir. Araç DMSO'sunun eşdeğer hacmini 2 mililitre LB'ye ekleyin ve NTBC olmayan ana çözeltiyi elde etmek için karıştırın. Bu iki ana çözelti, antibiyotik stok çözeltileri oluşturmanın yanı sıra 96 oyuklu plakalarda seyreltme serisini kurmak için kullanılacaktır.

Daha sonra, antibiyotik çözeltilerini LB artı NTBC veya LB artı DMSO ana çözeltilerinde hazırlayın. Gentamisin artı veya eksi NTBC stok çözeltisini mililitre başına 64 mikrogram olarak hazırlayın. Kanamisin artı veya eksi NTBC stok çözeltisini mililitre başına 256 mikrogram yapın. Tobramisin artı veya eksi NTBC stok çözeltisini mililitre başına 8 mikrogram olarak hazırlayın.

2X antibiyotik çözeltisi yapıldıktan sonra, her bir antibiyotik çözeltisinden 100 mikrolitreyi, A sırasındaki 96 oyuklu bir plakadaki dört oyuğa ekleyin. Örneğin, gentamisin A1'den A4'e yerleştirilmelidir. Kanamisin A5'ten A8'e yerleştirilmeli ve tobramisin A9'dan A12'ye yerleştirilmelidir.

96 oyuklu plakanın B'den H'ye kadar olan sıralarına 50 mikrolitre LB artı NTBC veya LB artı DMSO ana çözeltisi ekleyin. Bir plakanın LB artı NTBC ve bir plakanın LB artı DMSO olduğundan emin olun. Bir mikropipet başlığı kullanarak, 50 mikrolitre çözeltiyi A satırından B satırına aktararak antibiyotiklerin iki kat seri seyreltmelerini gerçekleştirin. Çözeltiyi karıştırın, pipet uçlarını değiştirin ve çözeltinin 50 mikrolitresini B satırından C satırına aktarın. Kalan satırlar için tekrarlayın.

G sırasını seyrelttikten sonra, o sıradan 50 mikrolitre çözeltiyi çıkarın ve atın. Bakteri üremesi için antibiyotiksiz kontrol olarak H satırını kullanın. Gece boyunca toplanan kültürleri alın. Ortamda bulunan biyomelanini ortadan kaldırmak için tüm kültürleri yıkadıktan sonra, kültürlerin OD_600'ünü ölçün. Gece boyunca kültürleri LB içinde seyreltin.

Çok kanallı bir mikropipet kullanarak, uygun kuyucuklara 50 mikrolitre seyreltilmiş bakteri kültürü ekleyin. Her suş ve antibiyotik konsantrasyonu için üç oyuğa bakteri ekleyin. Bakteriyel kontaminasyonu kontrol etmek için dördüncü kuyucuğa 50 mikrolitre LB ekleyin. 96 oyuklu plakaları parafilm ile örtün ve 37 santigrat derecede yaklaşık 24 saat inkübe edin.

Ertesi gün, kuyucuklarda bakteri üremesi için plakaları görsel olarak inceleyin. MIC, her bir suşun üç kopyası için de bakteri üremesinin görülmediği en düşük antibiyotik konsantrasyonudur.