Çok Değerlikli Gösteren Bir Dış Membran Vezikül Aşısı Oluşturulması

Bir polimere bağlı hedef plazmitleri içeren transfeksiyon poliplekslerini alın. Plazmitler, bir peptit etiketine ve bir afinite etiketine kaynaşmış bir viral antijeni kodlar.

Polipleksleri, endozomların içindeki polipleksleri içselleştiren memeli hücreleri ile inkübe edin.

Polimer vezikül yırtılmasına neden olur. Serbest bırakılan plazmitler, hücre dışı olarak salgılanan viral antijeni eksprese eder.

Antijen ve kirleticileri içeren süpernatanı hasat edin. Düşük konsantrasyonda rakip bir ajan ekleyin.

Bir afinite kromatografisi sütununa yükleyin.

Afinite etiketleri, antijeni hareketsiz hale getirerek kolon reçinesine bağlanırken, rakip ajan spesifik olmayan bağlanmayı azaltır.

Rakip maddeyi düşük bir konsantrasyonda akıtın ve zayıf bağlı kirleticileri uzaklaştırın.

Güçlü bir şekilde bağlanmış antijenleri uzaklaştırmak ve onları ayrıştırmak için artan rakip ajan konsantrasyonları ile yıkayın.

Bakteriyel dış zar veziküllerini veya OMV'leri yüzeye bağlı bir yakalama proteini ile tanıtın ve inkübe edin.

Antijen peptit etiketleri, yakalayan proteinlere bağlanarak çok değerlikli bir antijen ekranına sahip bir OMV aşısı oluşturur.

OMV SpyCatcher saflaştırmasını gerçekleştirin. Bakteri çözeltisini santrifüjleyerek başlayın. Süpernatanı 0,22 mikrometrelik bir membran filtre ile filtreleyin, ardından içi boş bir fiber sütun kullanarak konsantre edin. Konsantreyi 0.22 mikrometrelik bir membran filtreden süzün, daha sonra bir ultrasantrifüj kullanarak iki saat boyunca 4 santigrat derecede 150.000 kez g'de santrifüjleyin ve süpernatanı bir pipetle atın. Yağışı PBS ile tekrar askıya alın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

RBD-SpyTag transfeksiyonunu gerçekleştirmek için, uygun bir ökaryotik ekspresyon sistemi seçerek başlayın ve hücreleri iyileşmeden sonra 37 santigrat derecede dakikada 130 dönüşle gece boyunca kültürleyin. Otomatik hücre sayacına 20 mikrolitre HEK293F hücre çözeltisi ekleyin. Hücre sayısını kaydedin. Konsantrasyonu mililitre başına 1 kez 10 ila altıncı hücreye ayarlayın ve ardından hücreleri 4 saat boyunca 37 santigrat derecede dakikada 130 dönüşte kültürleyin.

RBD-SpyTag plazmitini 0.22 mikrometrelik bir membran filtreden süzün ve son hacim 10 mililitre olana kadar hücre kültürü ortamına 300 mikrogram plazmit ekleyin. 10 saniye çalkalayın. PEI'yi su banyosunda 65 santigrat dereceye ısıtın. 0.7 mililitre PEI'yi 9.3 mililitre hücre kültürü ortamı ile karıştırın ve 10 saniye boyunca aralıklı olarak çalkalayın.

PEI çözeltisine plazmit çözeltisi ekleyin. Karışımı aralıklı olarak 10 saniye çalkalayın ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Karışımı 280 mililitre hücre kültürü ortamına ekleyin ve 5 gün boyunca 37 santigrat derecede dakikada 130 dönüşte kültüre ekleyin.

Ardından, RBD-SpyTag saflaştırmasını gerçekleştirin. Hücreleri 20 dakika boyunca 25 santigrat derecede 6.000 kez g santrifüjleyerek başlayın. ve süpernatanı toplamak için bir pipet kullanın. Sütunu 2 mililitre nikel-NTA agaroz ile oluşturun ve PBS ile üç kez yıkayın.

20 milimolar final konsantrasyonunu yapmak için hücre süpernatantına imidazol ekleyin ve hücre süpernatantını yükleyin. Yıkama için 20 milimolar imidazol içeren 3 sütun hacmi PBS ekleyin ve yıkama fraksiyonunu toplayın. Düşük ila yüksek konsantrasyonlarda imidazol içeren üç sütun hacimli PBS ile gradyan elute. Her konsantrasyon için iki kez elute edin.

Protein konsantrasyonunu BCA yöntemiyle belirlemek için, standart BSA protein çözeltisini mililitre başına 2 ila 0.0625 miligram arasında seri olarak seyreltin. Saflaştırılmış OMV SpyCatcher ve RBD-SpyTag'i 10 kez seyreltin. Ardından, BCA çalışma çözümleri A ve B'yi 50'ye 1 oranında karıştırın. Seyreltilmiş protein çözeltisi ekleyin ve BCA çalışma çözeltisi ile karıştırın. 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Her bir oyuğun 562 nanometresindeki absorbansı ölçün ve standart eğriden protein konsantrasyonunu hesaplayın.

OMV SpyCatcher ve RBD-SpyTag'in biyokonjugasyonunu gerçekleştirmek için, OMV SpyCatcher'ı PBS'de RBD-SpyTag'de 40'a 1 oranında karıştırın. Karışımı gece boyunca 15 santigrat derecede dakikada 4 dönüşte karıştırmak için dikey olarak döndürün. OMV SpyCatcher saflaştırmasına benzer bir prosedür kullanarak PBS çözeltisi kullanarak OMV RBD'nin saflaştırılmasını gerçekleştirin.