Donmuş Embriyonik Nöronlardan Düşük Yoğunluklu Primer Nöron Kültürü Oluşturma

Dondurularak saklanmış embriyonik nöronlar içeren bir kriyoviyal ile başlayın ve kontrollü çözülme için bir ısıtma bloğuna yerleştirin.

Daha sonra, çözülmüş nöronları bir tüpe aktarın ve ozmotik basıncı dengelemek ve hücre lizizini önlemek için bunları bir nörobazal ortamla damla damla seyreltin.

Bu, düzgün dağılmış nöronlarla homojen bir süspansiyon oluşturur.

Seyreltilmiş nöral süspansiyonu, besinler ve antibiyotiklerle zenginleştirilmiş bir nörobazal ortam içeren poli-L-lizin kaplı çok kuyulu bir plaka üzerine tohumlayın.

Pozitif yüklü poli-L-lizinin, elektrostatik etkileşimler yoluyla nöronlarla etkileşime girmesine izin vermek için inkübe edin ve yapışmalarını kolaylaştırın.

Kuyucukları taze nörobazal ortamla besleyin.

Ortamın buharlaşmasını önlemek için hücreleri aynı ortamda nemli koşullar altında inkübe edin.

Embriyonik nöronlar besinleri kullanır ve nöronal süreçler geliştirerek ve birincil nöronlar oluşturarak büyür.

Nörobazal ortam, geniş aralıklı görünen birincil nöronları korur ve nöronal bağlantılara sahip düşük yoğunluklu bir birincil kültür oluşturur.

96 oyuklu bir mikroplakayı oyuk başına 100 mikrolitre poli-L-lizin ile kaplayarak başlayın. Daha sonra, plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, poli-L-lizin çözeltisini çıkarın. Plakaları iki kez sterilize edilmiş suyla ve bir kez ek içermeyen taze kültür ortamıyla yıkayın. Plakaları kuruması için dışarı koyun. Kuru plakalar sarılabilir ve 4 santigrat derecede bir aya kadar saklanabilir.

Hücre tohumlamasını başlatmak için, kaplanmış plakadaki her bir oyuğa 50 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Periferik kuyucukları 200 mikrolitre sterilize su ile doldurun ve plakayı% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Nöron kriyoviyalini sıvı nitrojen tankından çıkarın ve içeriğini kısmen çözmek için 37 santigrat derece ısı bloğuna yerleştirin. Geniş uçlu 1 mililitrelik bir pipet kullanarak, şişenin içeriğini yavaşça 50 mililitrelik steril bir tüpe damla damla aktarın. Boş kriyoviali 1 mililitre oda sıcaklığında kültür ortamı ile durulayın. Durulama solüsyonunu hücre süspansiyonunu içeren 50 mililitrelik tüpe aktarın.

Daha sonra, 9 mililitre oda sıcaklığında kültür ortamını 50 mililitrelik tüpe damla damla ekleyin ve hacmi 11 mililitreye çıkarın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri saydıktan sonra, hücre süspansiyonunu bir rezervuara aktarın. Şimdi, geniş delikli uçlara sahip çok kanallı bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu, oyuk başına 1,0 x 10⁴ hücrelik bir son sayımla kaplanmış 96 oyuklu plakaya dağıtın.

Nöronları% 5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede 1 ila 2 saat inkübe edin. Daha sonra kültür ortamını 100 mikrolitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ile değiştirin ve aynı koşullarda tekrar inkübe edin.