Transgenik Fare Yavrusu Beyninden Floresan Uyarıcı Nöronların Kültürlenmesi

Transgenik bir fare yavrusu beyni alın.

Beyincik çıkarın ve beyni inceleyin. Floresan protein eksprese eden uyarıcı nöronlar içeren kortiko-hipokampal dokuyu ayırın.

Dokuyu tampon içeren bir kültür plağına aktarın.

Dokuyu kıyın ve papain içeren bir tüpe aktarın.

Papain, dokunun hücre dışı matrisini sindirir ve nöronlar da dahil olmak üzere hücreleri gevşetir.

Sindirilmiş dokuyu BSA proteinleri içeren bir tüpe aktarın, enzimatik aktiviteyi durdurun ve hücresel hasarı önleyin.

Dokuları mekanik olarak ayrıştırır, hücreleri serbest bırakır.

Kalıntı ve enzimler içeren süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın.

Hücreleri düşük floresan nöronal ortamda yeniden süspanse edin ve hücre agregatlarını uzaklaştırarak bir hücre süzgecinden süzün.

Floresan nöronları tanımlamak ve sıralamak için floresanla aktive edilen hücre sıralaması gerçekleştirin.

Sıralanan nöronları bir mikrosantrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın. Nöronal ortamdaki nöronları yeniden askıya alın.

Çok kuyulu bir plakada poli-L-lizin kaplı lameller üzerindeki tohum nöronları. Nöronlar kaplanmış yüzeylere yapışır.

Nöronal medya ekleyin. Nöronal büyümeyi kolaylaştırmak için kuluçkaya yatırın.

İlk olarak, beyinciği inceleyin ve iki yarım küreyi ayırın. Ardından, hipokampus ve korteksi her yarım küreden dikkatlice ayırın. Diseke edilen dokuyu, soğutulmuş hücre kültürü tamponu içeren 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın.

Ardından, disseke edilmiş hipokampus ve korteksi başka bir 35 milimetrelik Petri kabının kapağına aktarın. Bir neşter bıçağının düz kenarını kullanarak, dokuyu sadece küçük parçalar kalana kadar çapraz hareketlerle dikkatlice doğrayın.

Daha sonra, doğranmış dokuyu az miktarda papain solüsyonu ile Petri kabı kapağından steril papain tüpüne aktarın. Dokuyu 37 santigrat derecede 25 dakika inkübe edin. Papain inkübasyonundan sonra steril papain tüpünü ve steril BSA tüplerini akış kabinine aktarın. Ardından, papain tüpünden sadece kortiko-hipokampal dokuyu BSA tüpüne 1 aktarmak için 1 mililitrelik bir Pasteur pipeti kullanın.

Büyük doku kümelerini parçalamak için, 1 mililitrelik bir Pasteur pipeti kullanarak dokuyu birkaç kez ezin. Bunu takiben, ince uçlu bir Pasteur pipeti kullanarak dokuyu yedi kez ezin. 30 saniye sonra, 1 mililitre alt çözelti ve dokuyu BSA tüpü 1'den BSA tüpü 2'ye aktarın.

İnce uçlu bir Pasteur pipeti kullanarak BSA tüpü 2'deki dokuyu birkaç kez ezin. Tritürasyondan sonra, çözelti içindeki alt dokunun 1 mililitresini BSA tüpü 1'den BSA tüpü 3'e aktarın. BSA tüpü 3'teki dokuyu birkaç kez tritüre edin.

Tritürasyondan sonra, tüm çözelti ve dokuyu tüp 2 ve 3'ten BSA tüp 1'e aktarın. 2 ila 3 kez daha ezin ve 3 dakika boyunca 3.000 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı peletlenmiş dokudan dikkatlice çıkarın ve 2 mililitre tam Hibernate A düşük floresan ortamında bir P1000 pipeti kullanarak hücreleri yeniden süspanse edin. Ardından, doku çözeltisinin tamamen yeniden süspansiyonunu sağlamak için dokuyu 20 kez ezin.

Daha sonra, hücre süspansiyonunu 30 mikrometrelik bir hücre süzgecinden bir polistiren numune tüpüne süzün. 300 mikrolitre tam Hibernate A ortamını gerekli sayıda polipropilen tüpe pipetleyerek hücre ayırma toplama tüplerini hazırlayın.

Sıralanacak her floresan hücre tipi için uygun uyarma ve emisyon filtrelerini seçin. 488 nanometre uyarma dalga boyunu kullanarak venöz proteini uyarın ve yayılan ışığı 530 üzerinden 40 emisyon filtre seti ile tespit edin.

531 nanometre uyarma dalga boyunu kullanarak TdTomato proteinini uyarın ve 575 üzerinden 30 emisyon filtre seti ile yayılan ışığı tespit edin. Yüksek saflık için, parlak etiketli floresan hücreleri sıralayın. Hücre tasnif işleminden sonra, toplanan hücreleri 2 mililitrelik yuvarlak tabanlı santrifüj tüplerine aktarın. Daha sonra, bir hücre peleti oluşturmak için hücreleri 3,000 kez g'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin.

Mikrolitre başına 1.000 hücrelik bir hücre yoğunluğu elde etmek için hücre peletini gerekli miktarda önceden ısıtılmış tam NBA ortamında yeniden süspanse edin. Ayrışmış hücrelerin varlığını doğrulamak için, hücre çözeltisini 4x veya 10x objektif lens kullanarak mikroskop altında kontrol edin. Hücreleri kaplamadan önce, eşit bir hücre süspansiyonu sağlamak için 2 ila 3 saniye orta hızda girdap yapın.

Girdaplamayı takiben, 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu her bir lamel ortasına hızlı bir şekilde pipetleyin. Bir saat sonra, hücreleri 500 mikrolitre önceden ısıtılmış tam NBA ortamı ile besleyin ve 37 santigrat derecede inkübatöre geri dönün.