İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Postganglionik Sempatik Nöronların Üretilmesi

Hücre dışı matris kaplı bir mikroplaka alın ve bir farklılaşma ortamında süspanse edilmiş insan pluripotent kök hücrelerini ekleyin.

Ortam, hücresel sinyal yollarını etkileyen ve nöral progenitör hücrelere farklılaşmayı yönlendiren sinyal molekülleri içerir.

Nöronal ve nöronal olmayan hücrelerin öncüleri olan nöral krest hücrelerine veya NCC'lere farklılaşmayı indükleyen sinyal molekülleri içeren başka bir farklılaşma ortamı tanıtın.

Matrisi bozmak için enzimler ekleyin, böylece hücreleri ayrıştırın.

Enzimleri nötralize etmek için yıkayın, ardından süpernatanı santrifüjleyin ve atın. NCC'leri küresel bir ortamda yeniden süspanse edin ve bunları bir mikroplakaya aktarın.

Ortamın büyüme faktörleri ve küçük molekülleri küresel oluşumu indükler.

Sempatik progenitör nöronlara farklılaşmayı destekleyen retinoik asit ile takviye edilir.

Sferoidi, sempatik bir nöron olgunlaşma ortamında yapışma proteini kaplı bir mikroplaka üzerine aktarın ve sferoid bağlanmasına neden olun.

Ortamdaki nöral büyüme faktörleri ve retinoik asit, periferik sinir sisteminin bir parçası olan ve istemsiz süreçleri düzenleyen postganglionik sempatik nöronlara olgunlaşmayı teşvik eder.

Farklılaşma indüksiyonundan bir gün önce, uygun sayıda altı oyuklu plakayı oyuk başına iki mililitre bazal membran matrisi ile kaplayın ve plakaları gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Ertesi sabah, plakaları oda sıcaklığına ısıtın ve bölünmeye hazır insan pluripotent kök hücre kültürünü yıkama başına taze PBS ile iki kez yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, yüzen insan pluripotent kök hücrelerini aspire etmeden ve hasat edilen hücreleri 50 mililitrelik bir tüpe aktarmadan önce, hücre kültürü inkübatöründe 15 dakika boyunca hücrelere yedi mililitre 0.5 milimolar EDTA uygulayın.

EDTA'yı seyreltmek için tüpe eşit hacimde PBS ekleyin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Peleti 01. gün farklılaşma ortamının bir mililitresinde yeniden süspanse edin. Sayım için uygun bir hacimde ortam eklemeden önce, hücreleri oyuk başına iki mililitre farklılaşma ortamında santimetre kare başına 1.25 x^{10 5} hücre konsantrasyonuna seyreltin.

Önceden hazırlanmış altı oyuklu plakanın her bir oyuğundan tüm bazal membran matris çözeltisini aspire edin. Daha sonra, her bir oyuğa 2 mililitre hücre tohumlayın ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Ertesi sabah, hücreleri kuyu başına 3 mililitre 01. gün farklılaşma ortamı ile besleyin.

Farklılaşmanın ikinci gününde, hücreleri kuyu başına üç mililitre iki ila on farklılaşma ortamı ile besleyin. Ardından, hücreleri 10. güne kadar her gün besleyin. Nöral krest hücrelerini sferoidler halinde toplamak için, 10. günde, hücreleri PBS ile yıkayın ve her oyuğa iki mililitre ayrışma ortamı ekleyin. Hücre kültürü inkübatöründe 20 dakika sonra, yüzen hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tüpteki süspansiyon hacmini taze PBS ile 50 mililitreye getirin.

Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti sayım için 10 ila 14 günlük küresel ortamda yeterli bir hacimde yeniden süspanse edin. Saydıktan sonra, hücreleri 10 ila 14 küresel ortam kullanarak 500 mikrolitre konsantrasyon başına 5 x 10⁵ hücreye seyreltin ve ultra düşük ekli 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre hücre yerleştirin. Daha sonra hücreleri hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

Minimal bir sferoid kültürü indüklemek için, kültürün 11. gününde, nöral krest sferoidlerini oyuk başına 10 ila 14 günlük 500 mikrolitre ek bir sferoid ortamla besleyin. 12. günde, sferoidleri plakanın bir tarafında biriktirmek için plakayı eğin ve sferoidleri aspire etmeden her bir oyuktan mümkün olduğunca fazla besiyerini dikkatlice aspire edin. Daha sonra, sferoidleri kuyu başına 10 ila 14 küresel ortam günde bir mililitre ile besleyin.

15. günde genişletilmiş bir sferoid kültürü indüklemek için, sferoidleri kuyucuk başına 0,5 mikromolar retinoik asit ile desteklenmiş 10 ila 14. günde 1,5 mililitre küresel ortamla besleyin. Ardından, sferoidleri hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

14. veya 28. günde sempatik nöron farklılaşması için, plakanın bir tarafında sferoidleri biriktirmek için plakayı eğin ve mümkün olduğunca fazla ortamı dikkatlice aspire edin. Hücreleri bir mililitre sempatik nöron ortamı ile besleyin.

Büyük sferoid agregaları daha küçük sferoidlere bölmek için, oyuk başına bir mililitreden fazla ortam eklemeyin ve sferoidleri bölmeden önce beş ila 10 kez pipetleyin.

Ve fazla laminin fibronektini önceden hazırlanmış 24 oyuklu plakalardan çıkarın. Plakayı, 24 oyuklu küresel kültür plakası üzerindeki her oyuktan bir mililitre sferoidi, yeni kaplanmış 24 oyuklu plakanın dört ayrı oyuğu arasında bölün. Her oyuğa 250 mikrolitre taze sempatik nöron ortamı ekleyin ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Ertesi sabah, her bir oyuktaki ortamı 0.125 mikromolar retinoik asit ile takviye edilmiş bir mililitre sempatik nöron ortamı ile değiştirin ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. 35. günden sonra, her bir oyuktaki mevcut ortamın sadece yarısını taze ortamla dikkatlice değiştirerek nöronları besleyin.