Zebra Balığı Nöral Kök Hücrelerinden Primer Nörosferlerin Üretilmesi ve Farklılaşması

Büyüme faktörleri ile zenginleştirilmiş bir büyüme ortamı içeren çok kuyulu bir plaka ile başlayın.

Zebra balığı nöral kök hücrelerinin tek hücreli bir süspansiyonunu tohumlayın ve kuluçkaya yatırın.

Başlangıçta, kök hücreler büyüme faktörlerini kullanır ve çoğalır.

Serbest yüzen birincil nörosferler oluşturmak için sürekli hücre proliferasyonunu ve spontan agregasyonu teşvik etmek için kalıntıları çıkarın ve taze ortamı ekleyin.

Daha sonra, nörosferleri büyüme ortamını içeren taze bir kuyuya aktarın.

Nörosferlerin ilerleyici bir şekilde genişlemesini sağlamak için aynı koşullar altında kuluçkaya yatırın.

Nörosferleri mekanik olarak küçük kümelere ayırmak için tekrar tekrar pipetleyin.

Daha sonra, yapışmalarını kolaylaştırarak onları hücre dışı bir matris kaplanmış kuyu üzerine aktarın.

Büyüme ortamını, insülin içeren büyüme faktörü içermeyen bir farklılaşma ortamı ile değiştirin.

Büyüme faktörlerinin yokluğu ve insülinin varlığı, nöronal projeksiyonlarla glial hücrelere ve nöronlara hücre farklılaşmasını uyarır.

Nörosfer oluşumuna hazırlanmak için, 24 oyuklu bir plakanın her bir kuyusunu 300 mikrolitre taze Z-koşulu ortamı ile doldurun. Daha sonra, her bir oyuğa 200 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve bunları mikrolitre başına yaklaşık 500 hücre yoğunluğunda tohumlayın. Daha sonra, plakayı 30 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde inkübe edin.

Bir günlük kültürden sonra, 24 oyuklu plakadaki hücreleri mikroskop altında görüntüleyin. Bu aşamada tek hücreli süspansiyonları gözlemlemeyi bekleyin. Bir kuyunun ortasında herhangi bir kalıntı toplandığı görülürse, yaklaşık 100 mikrolitre ortam pipetleyerek çıkarın ve bu sıvıyı 100 mikrolitre taze Z koşulu ortamı ekleyerek değiştirin. Tüm kalıntılar çıkarıldıktan sonra, plakayı daha önce açıklanan koşullar altında inkübe edin.

Ek bir kültür gününden sonra, 250 mikrolitre hücre süspansiyonunu tek bir kuyudan yeni, boş bir kuyuya aktarın. 24 kuyunun tümü için bu adımı tekrarlayın. Ardından, her bir oyuğa 250 mikrolitre taze Z-koşul ortamı ekleyin ve süspansiyonları hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin. Plakaları aynı koşullar altında tekrar inkübe edin ve ek bir kültür gününden sonra bu genişletme prosedürünü tekrarlayın. Bu dönemin üçüncü ve dördüncü günlerinde nörosferlerin boyutunda ilerleyici bir artış gözlemlemeyi bekleyin.

Geçmeye başlamak için, dört gün sonra, her kuyucuktan 250 mikrolitre ortamı çıkarın, ancak nöroküre çıkarmayın. Ardından, kalan orta hacimdeki nörosferleri mekanik olarak ayırmak için 1 mililitrelik bir pipet kullanın. Hücre süspansiyonunu her ayrışmış kuyudan havuzlamaya devam edin. Daha sonra, hücreleri bir hemositometre ile sayın ve mikrolitre başına 800 hücre içeren 250 mikrolitre birincil kültür süpernatantını yeni bir 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna dağıtın. Her bir oyuğa 250 mikrolitre Z koşulu ortamı ekleyerek ve ardından plakayı daha önce tarif edildiği gibi inkübe ederek devam edin.