İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Serebral Organoidlerin Üretilmesi

Destekleyici bir matris üzerinde kültürlenmiş indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin veya iPSC'lerin kolonilerini alın.

Kolonileri tek hücrelere ayırmak için enzimler içeren bir çözelti ekleyin.

Hücreleri bir tüpe aktarın, santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

iPSC'leri bir büyüme ortamında yeniden askıya alın.

Hücreleri biyouyumlu polimer lifleri içeren bir mikroplakaya aktarın.

Polimer iskele üzerinde embriyoid cisimler veya EB'ler oluşturan iPSC'leri zorla toplamak için santrifüjleyin.

iPSC proliferasyonunu ve nöral kök hücrelere, progenitör hücrelere ve olgunlaşmamış nöronlara farklılaşmasını destekleyen bir nöral indüksiyon ortamına geçiş.

Kuluçka üzerine, hücreler kendi kendine organizasyona uğrar.

Embriyoid cisimciklerini çukurlu bir tabaka üzerine yerleştirin ve hücre dışı matris proteinleri içeren damlalar ekleyin.

EB'leri gömerek matrisi katılaştırmak için inkübe edin.

EB'leri bir nöral bakım ortamı içeren bir mikroplakaya aktarın. Kuluçkaya yatmak.

EB'ler, çıkıntılar ve tomurcuklanmalar oluşturmak ve olgun nöronlara farklılaşarak serebral organoidler oluşturmak için hücresel proliferasyona uğrar.

Ortamı bir pipetle aspire edin ve hücreleri bir kez DPBS ile yıkayın. Daha sonra, kolonileri ayırmak için 500 mikrolitre hücre ayırma çözeltisi veya 0.5 milimolar EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede 3 ila 5 dakika inkübe edin. Ardından, her bir oyuğa 1 mililitre taze E8 ortamı ekleyin ve tüm hücreleri ayırmak için hafifçe pipetleyin.

Tüm hücre süspansiyonunu 15 milimetrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 1 mililitre daha taze E8 ortamı ekleyin. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 290 g'da döndürün.

Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini 50 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 1 mililitre E6 ortamında yeniden süspanse edin ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.

ROCK inhibitörü ile desteklenmiş E6 ortamında istenen oturma yoğunluğuna sahip bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Ardından, 96 oyuklu ultra düşük bağlantı plakasının her bir oyuğuna 150 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Daha sonra, hücreleri toplamaya zorlamak için plakayı oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 290 g'da santrifüjleyin. Daha sonra, embriyoid vücut oluşumu için% 5 karbondioksit ile nemlendirilmiş bir atmosferde plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.

24 saatlik inkübasyondan sonra, plakayı davlumbaza aktarın ve pipet ucunu kuyucuğa çok fazla indirerek embriyoid gövdeyi aspire etmemeye dikkat ederek bir pipet kullanarak 120 mikrolitre ortamı dikkatlice aspire edin.

Daha sonra, her bir oyuğa 2 mikromolar XAV939 ve SMAD inhibitörleri ile desteklenmiş 150 mikrolitre taze E6 ortamı ekleyin. Plakayı inkübatöre geri aktarın ve ortamı günlük olarak inhibitörlerle desteklenmiş taze hazırlanmış E6 ile değiştirin.

Kuluçka döneminin yedinci gününde, tüm embriyoid cisimlerinin 550 ila 600 mikrometre çapa ulaşıp ulaşmadığını kontrol edin ve pürüzsüz, net bir kenar gösterin. Bu aşamada, hücre dışı bir matrise gömülmeye hazırdırlar.

Organoidleri gömmek için, boş bir P4 kutusuna 200 inç uzunluğunda bir termoplastik sızdırmazlık filmi tabakası yerleştirerek çukurlu gömme tabakaları hazırlayın. Daha sonra 15 mililitrelik bir konik tüp veya 500 mikrolitrelik bir mikrosantrifüj tüpü kullanın ve 12 veya istenen sayıda çukur yapmak için film tabakasını deliklere hafifçe bastırın.

Ardından, film tabakasına %70 etanol püskürtün ve UV ışığı açıkken kaputun içinde en az 30 dakika kurumaya bırakın. Bu arada, yeterli miktarda bazal membran matrisini buz üzerinde çözdürün. Daha sonra, geniş delikli bir P200 ucu kullanarak, 96 oyuklu plakadan bir embriyoid gövdesini her bir çukura aktarın. Normal bir pipet ucuyla mümkün olduğunca fazla ortamı çıkarın, ancak embriyoid gövdesinin kurumasına izin vermeyin.

Daha sonra, düzenli bir önceden soğutulmuş P200 ucu ile, her bir organoide yaklaşık 30 mikrolitre seyreltilmemiş membran matrisi ekleyin ve embriyoid gövdesinin damlacığın merkezine mümkün olduğunca yakın olmasını sağlayın.

Tüm embriyoid cisimler matrise gömüldükten sonra, film tabakasını steril bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra Petri kabını 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca nemlendirilmiş bir atmosferde% 5 karbondioksit ile inkübe edin ve membran matrisinin katılaşmasına izin verin.

Organoid farklılaşması için, A vitamini içermeyen B27 ile hazırlanan farklılaşma ortamının 5 mililitresini, ultra düşük bağlantılı 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna ekleyin. Plakayı bir inkübatörde 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Membran matrisi katılaştıktan sonra, gömülü embriyoid cisimciklerini, film tabakasının arkasından çukurları dışarı iterek 6 oyuklu plakaya aktarın. Gerekirse, kuyudan 1 mililitre ortam kullanın ve damlacıkları film tabakasından ayırmak için tabakaya pipetleyin.