Mikroakışkan bir cihaz kullanarak nöromüsküler kavşakların oluşturulması

Mikro oluklarla birbirine bağlanan aynalı bölmeleri taşıyan birbirine bağlı kuyulara sahip polimer kaplı bir mikroakışkan cihazla başlayın.

Nöral progenitör hücreleri bir bölmenin kuyularına tohumlayın.

Birbirine bağlı kanala göç etmelerine ve polimere yapışmalarına izin verin.

Motor nöronlara nöronal olgunlaşmayı teşvik etmek için bir büyüme ortamı ile kaplayın.

Karşı bölmede, kuyucukları birbirine bağlı kanala göç eden ve yapışan kas progenitör hücreleri ile tohumlayın.

Ortamı, kas progenitör hücrelerinin füzyonunu indükleyen ve çok çekirdekli kas hücreleri oluşturan bir farklılaşma ortamı ile değiştirin.

Kas hücresi içeren bölmeye büyüme faktörleri içeren nöron farklılaşma ortamı ekleyin.

Bu arada, nöral hücre içeren bölmeye yarım hacimde büyüme faktörü içermeyen ortam ekleyin.

Büyüme faktörleri ve karşı bölmedeki daha yüksek hacimdeki ortam, motor nöronların süreçlerini mikro oluklar boyunca uzatmalarını teşvik eder.

Bu nöronal süreçler daha sonra kas hücreleri ile birleşerek nöromüsküler kavşaklar oluşturur.

Mikroakışkan cihazdaki nöral progenitör hücreleri veya NPC'leri kaplamak için, 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak cihazdaki mikro olukların bir tarafındaki iki kuyudan DPBS'yi çıkarın. Sağ üst kuyuda cihaz başına 60 ila 100 mikrolitre 10 motor nöron ortamında toplam 250.000 NPC'yi tohumlamak için, hücre süspansiyonunun yarısını 45 derecelik bir açıyla kanal açıklığına yakın tohumlayın.

Hücre süspansiyonunun kalan yarısını alt kuyucuğa eklemeden önce hücre süspansiyonunun kanaldan akmasına izin vermek için birkaç saniye duraklayın. Cihazın mikroskop olmadan kolay yönlendirilmesi için tohumlanan tarafı NPC veya eşdeğeri olarak işaretlemek için bir kalem kullanın ve hücre bağlantısı için beş dakika inkübe edin. Daha sonra, iki NPC tohumlu kuyuyu, kuyu başına toplam 200 mikrolitre hacme kadar ek bir gün 10 motor nöron ortamı ile yavaşça doldurun. 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, taze tohumlanmış NPC'lerin karşısındaki mikro olukların diğer tarafındaki iki kuyudan DPBS'yi çıkarın.

Tohumlanmamış kuyucuklara oyuk başına 200 mikrolitre 10 motor nöron ortamı ekleyin. Ardından, inkübasyon sırasında ortamın buharlaşmasını önlemek için cihazın etrafındaki 10 santimetrelik çanak başına 6 mililitre DPBS ekleyin.

Ortamı değiştirmek için, 200 mikrolitrelik pipet ucunu kuyu duvarının alt kenarına kanal açıklığının karşısına yerleştirerek NPC'lerle her iki kuyucuktaki ortamı yavaşça çıkarın. Güçlü bir ortam akışının kanaldaki hücrelere zarar vermesini önlemek için, üst ve alt kuyu arasında sürekli geçiş yaparak her oyuğa yavaşça 50 ila 100 mikrolitre taze motor nöron ortamı ekleyin. Her kuyucuk 200 mikrolitre ortam içerene kadar işlemi tekrarlayın.

Motor nöron farklılaşmasının 17. gününde, cihazdaki mikro olukların tohumlanmamış tarafındaki motor nöron ortamını 200 mikrolitrelik bir pipet ile çıkarın ve kuyuları DPBS ile yıkayın. Hücre süspansiyonunun yarısını üst kuyuya tohumlayarak cihaz başına 60 ila 100 mikrolitre büyüme ortamında toplam 200.000 insan birincil mezoanjiyoblastı veya MAB'yi tohumlayın.

NPC'leri kaplamak için daha önce gösterildiği gibi, hücre süspansiyonunun kalan yarısını alt kuyucuğa ekmeden önce hücre süspansiyonunun kanaldan akmasına izin vermek için birkaç saniye duraklayın. Hücre bağlantısı için cihazı beş dakika inkübe edin. Ardından, iki taze MAB tohumlu kuyucuğu ek bir büyüme ortamı ile doldurun ve gösterildiği gibi tekrar inkübe edin.

Motor nöron farklılaşmasının 21. gününde kemotaktik ve hacimsel gradyanı başlatmak için, miyotüp bölmesine büyüme faktörleri içeren motor nöron bazal ortamının kuyusu başına 200 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, motor nöron bölmesine büyüme faktörleri içermeyen motor nöron bazal ortamının kuyusu başına 100 mikrolitre ekleyin.