Nöron-glia etkileşimlerini incelemek için dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültür tekniği

Poli-D-lizin ile kaplanmış geçirgen bir membran eki içeren çok kuyulu bir plaka ile başlayın.

Kuyuya astrosit büyüme ortamı ekleyin ve özel bir glial hücre olan astrositleri eke ekleyin.

Elektrostatik etkileşimler yoluyla poli-D-lizin üzerinde hücre yapışmasına izin vermek için inkübe edin ve bir tek tabaka oluşturun.

Astrosit ortamını bir nöron kültürü ortamı ile değiştirin.

Bu eki, polimer kaplı bir lamel üzerine yapışmış birincil fare embriyonik nöronları içeren çok kuyucuklu bir plakaya aktarın.

İki hücre tipinin fiziksel olarak ayrıldığı ancak aynı kültür ortamını paylaştığı dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültürü oluşturmak için kuluçkaya yatırın.

Astrositler, nöronun hayatta kalması ve büyümesi için gerekli olan çeşitli nörotrofik faktörleri salgılar.

Bu faktörler geçirgen destek yoluyla göç eder ve birincil nöronlarla etkileşime girer. Bu, farklılaşmalarını teşvik eder ve nöronal projeksiyonlar oluşturur.

Bu çıkıntılar uzar ve nöronlar arasında sinaptik bağlantılar kurar, bu da nöron-glial etkileşimleri gösterir.

Her bir parçayı mililitre poli-D-lizin başına 10 mikrogram ile kaplayın ve bir saat inkübe edin. Bir saat sonra, ekleri PBS ile iki kez yıkayın.

Bu arada, astrosit ortamını aspire edin ve artık serumun çıkarıldığından emin olmak için kültürü bir kez 10 mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra, şişelere 3 mililitre% 0.05 tripsin EDTA ekleyin ve hücreleri yaklaşık 10 dakika boyunca tripsinizasyon için inkübe edin. Daha sonra, hücreleri 7 mililitre astrosit ortamında yavaşça yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 216 kez g'de beş dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini 1 mililitre astrosit ortamında yeniden süspanse edin. Bir sayma odası kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra, 24 oyuklu plakayı kuyucuk başına 500 mikrolitre astrosit ortamı ile doldurun. PBS'yi aspire edin ve 500 mikrolitre astrosit ortamındaki 25.000 hücreyi her bir ek parçaya aktarın ve kültürü 37 santigrat derecede inkübe edin.

Hipokampusu incelemek için, hazırlama ortamı ile doldurulmuş üç adet 10 santimetrelik tabak ve 1 mililitre hazırlama ortamı ile bir adet 2 mililitrelik tüp hazırlayın. Hipokampusu korteks parçalarından ayırın ve bunları hazırlama ortamı ile doldurulmuş 2 mililitrelik bir tüpte toplayın.

Hipokampusun, CNS'nin diğer bölgelerinden herhangi bir bitişik doku olmadan izole edilmesi kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, hipokampus çıkarıldıktan sonra, yabancı kontamine edici dokuların ek olarak çıkarılması gerekir.

Diseksiyondan sonra, tüpü steril bir laminer akış tezgahına aktarın. Hazırlama ortamını dikkatlice çıkarın ve hipokampal dokuyu papain içeren 1 mililitre sindirim solüsyonu ile sindirin. 15 dakikalık sindirimden sonra, bir pipetle hafifçe emerek sindirim solüsyonunu dikkatlice geri çekin.

Nöronun yüksek hassasiyeti nedeniyle, kabarcıkları önlemek ve optimum öğütme yoğunluğunu elde etmek için hipokampusu dikkatli bir şekilde ezmek çok önemlidir.

Yıkama döngüsü başına 1 mililitre taze kültür ortamı ekleyerek ve dikkatlice aspire ederek hipokampusu nöron ortamı ile üç kez yıkayın. Son yıkama adımından sonra, dokuyu 1 mililitre nöron ortamında dikkatlice ezin. Ardından, bir sayma odası kullanarak hücreleri sayın. 24 oyuklu plakanın oyuğu başına 500 mikrolitre nöron ortamında 35.000 hücre plakalayın ve nöronları bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Şimdi, birleşik astrosit tek katmanları ile tohumlanmış hazırlanmış ekleri inkübatörden çıkarın. Astrosit ortamını aspire ederek ve onu 500 mikrolitre taze nöron ortamı ile değiştirerek ortamı değiştirin.

Daha sonra, astrositli ekleri steril forseps kullanarak nöron kültürlerini içeren kuyucuklara dikkatlice yerleştirin. Daha sonra, elde edilen dolaylı nöron astrosit ko-kültürünü, deneylere kadar inkübatöre geri yerleştirin.