JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 4:51 dk • July 8th, 2025
Bir fare korteksini küçük parçalar halinde kesin ve tamponlanmış bir tuz çözeltisi içeren soğuk bir diseksiyon ortamına aktarın.
Hücre dışı matrisi ayırmak için sindirim enzimleri ekleyin.
Artık enzimleri çıkarmak için soğuk diseksiyon ortamı ile yıkayın.
Bu ortamı bir astrosit zenginleştirme ortamı ile değiştirin.
Ardından, doku parçalarını ayırmak için bir pipet kullanın.
Ayrışmamış dokuyu çıkarmak ve tek hücreler elde etmek için süspansiyonu bir süzgeçten geçirin.
Hücreleri pozitif yüklü polimer kaplı bir plakaya aktarın. Çalkalayarak inkübe edin.
Astrositler sıkıca yapışırken, gevşek bağlı nöronlar, mikroglia ve oligodendrositler ayrılır.
Zenginleştirme ortamı, olgun astrositleri bölen poligonal astrositlere dönüştürür.
Ayrılan hücreleri çıkarın ve astrositleri bir fosfat tamponu ile yıkayın.
Astrositleri ayırmak için sindirim enzimleri ekleyin.
Enzimatik aktiviteyi durdurmak için serum içeren bir ortam ekleyin. Astrositleri bir tüpte toplayın ve santrifüjleyin.
Süpernatanı atın. Tipik bir yıldız şeklindeki olgun astrosit yapısını teşvik etmek için bir astrosit olgunlaşma ortamındaki hücreleri yeniden süspanse edin.
Astrosit üretmek için kullanılacak herhangi bir kortikal dokuyu 1 milimetre küpten büyük olmayan parçalar halinde kesin. Tüm doku parçaları toplandıktan sonra, tüpün dibine çökmelerini bekleyin. Ardından, mümkün olduğu kadar çok ortamı aspire edin. Bunu takiben, 2 ila 3 mililitre% 0.05 tripsin EDTA ekleyin ve numuneleri 37 santigrat derece su banyosunda 20 dakika inkübe edin.
Daha sonra, tripsin EDTA'yı dikkatlice aspire edin ve doku parçalarını tüpün dibinde minimum miktarda sıvı içinde bırakın. Daha sonra, kalan tripsin EDTA'yı yıkamak için 5 mililitre önceden soğutulmuş diseksiyon ortamı ekleyin ve doku parçalarının karıştırılmasını sağlamak için üst tüpün yan tarafına pipetleyin. Daha sonra diseksiyon ortamını aspire edin ve doku parçalarını mümkün olduğunca az sıvı içinde bırakın.
Bu yıkama adımını önceden soğutulmuş diseksiyon ortamı ile iki kez tekrarlayın. Son yıkama adımından sonra, 1 mililitre oda sıcaklığında DMEM PLUS ekleyin ve kabarcıklar oluşturmadan yukarı ve aşağı pipetleyerek dokuyu titre edin.
Astrositler pH'a karşı oldukça hassastır, bu nedenle çözeltinin pH'ını değiştirebileceğinden kabarcık üretmekten kaçınmak önemlidir.
Ardından, 50 mililitrelik bir tüpün ağzına 100 mikronluk bir hücre süzgeci yerleştirin ve filtreyi 4,5 mililitre önceden soğutulmuş DMEM PLUS ile önceden ıslatın. Ayrışmış doku süspansiyonunun 1 mililitresini hücre süzgecine pipetleyin ve hücreleri içinden yıkamak için 4,5 mililitre daha önceden soğutulmuş DMEM PLUS ekleyin. Diseksiyondan sonra in vitro 7. günde, DMEM PLUS'taki hücrelerle 10 santimetrelik tabakları inkübatördeki bir çalkalayıcıya yerleştirin ve bulaşıkları altı saat boyunca 110 RPM'de çalkalayın.
Altı saatlik çalkalamanın bitiminden 20 ila 30 dakika önce, su banyosunda 1X PBS, DMEM PLUS, NB + H ve% 0.25 tripsin EDTA'yı 37 dereceye kadar ısıtın. Altı saat çalkaladıktan sonra, kültür kaplarını çalkalayıcıdan çıkarın ve ortamı hemen tabak başına 10 mililitre önceden ısıtılmış 1X PBS ile değiştirin. Daha sonra, PBS'yi çıkarın ve tabak başına 3 mililitre önceden ısıtılmış tripsin EDTA ekleyin.
Ardından, numuneleri 37 santigrat derecede dört dakika inkübe edin. Daha sonra, her tabağa 3 mililitre tripsin EDTA'ya 5 mililitre önceden ısıtılmış DMEM PLUS ekleyin. Hücreleri tabaktan pipetleyin ve hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. Bundan sonra, hücre süspansiyonunu dört dakika boyunca 20 santigrat derecede 3.220 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı çıkarın, ardından hücre peletini 1 mililitre önceden ısıtılmış NB + H içinde yeniden süspanse edin.